PROTEAASI K: OMINAISUUDET, ENTSYMAATTINEN AKTIIVISUUS, SOVELLUKSET - BIOLOGIA - 2026

K proteinaasi on entsyymi, joka kuuluu ryhmään seriiniproteaasien, eli se on sen keskellä katalyyttisesti aktiivisen aminohapon seriini ja sen tehtävänä on katkaista peptidisidoksia hydrolyysillä. Tämä entsyymi puolestaan ​​kuuluu subtilisiiniproteiinien (peptidaasi S8) perheeseen.

Proteinaasi K: n molekyylipaino (MW) on 28 900 daltonia, ja se eristettiin ensimmäistä kertaa vuonna 1974 Engyodontium-albumin sienen otteista, aiemmin tunnetuin nimellä Tritirachium album Limber.

Proteinaasi K.: n molekyylirakenne. Lähde: Lykchiniadis

Sillä on korkea proteolyyttinen kapasiteetti, mitä osoittaa kyky hajottaa hiusten sisältämää keratiiniä. Sana keratin englanniksi on kirjoitettu "keratin", joten sitä on kutsuttu "proteinaasi K".

Koska entsyymi on erittäin tehokas pilkkomaan luonnollisia proteiineja, se on käyttökelpoinen erilaisissa molekyylibiologisissa tekniikoissa. Sitä käytetään ensisijaisesti korkean molekyylipainon (MW) nukleiinihappojen eristämiseen ja valmistamiseen.

Proteinaasi K toimii vapauttamalla ydin-DNA: ta, samalla kun tuhoaa proteiineja ja inaktivoi RNaasit ja DNaasit, ts. Se eliminoi nukleaasit DNA- ja RNA-valmisteissa.

Toisaalta on nähty, että proteinaasi K voi hydrolysoida joitakin denaturoituja natiivia proteiineja, mikä on herättänyt tutkijoiden mielenkiinnon sen käytölle prioniproteiinien (PrPC) tutkimuksessa.

Huolimatta korkeasta proteolyyttisestä potentiaalistaan, on proteiineja, jotka ovat resistenttejä proteinaasi K: n vaikutukselle. Niiden joukossa on joitain epänormaaleja proteiineja, joita kutsutaan prionaiksi (PrPSc) ja jotka liittyvät tarttuviin spongiformisiin enkefalopatioihin.

Proteinaasi K -ominaisuudet

Proteinaasi K: lla on tertiäärinen rakenne, joka koostuu kolmesta kerroksesta, seitsemän ketjun beetalevyn ollessa sijoitettu kahden heliksiikerroksen väliin. Koska se kuuluu peptidaasien S8-perheeseen, sille on tunnusomaista, että sen aktiivisessa paikassa on katalyyttinen triadi, jonka peräkkäinen järjestys on (Asp, His ja Ser), joka erottaa ne muista peptidaasien perheistä.

Tämä entsyymi seriiniproteaasien ryhmästä on ominaista hydrolysoimalla peptidisidokset lähellä alifaattisten ja aromaattisten aminohappojen karboksyyliryhmää.

Toisaalta se pystyy toimimaan tiettyjen syövyttävien aineiden, kuten natriumdodekyylisulfaatin (SDS), Tris-HCL: n ja EDTA: n, läsnäollessa, joita käytetään proteiinien denaturoitumiseen auttaen niitä menettämään luontaista rakennettaan.

Tämä on alustava vaihe valmistettaessa proteiineja elektroforeesitekniikkaa varten. PH-alue, jolla proteinaasi K toimii, on melko leveä (2,0 - 12,0), optimaalisen pH: n ollessa 7,5 - 12,0, ja sen isoelektrinen piste on 8,9. Kuten voidaan nähdä, se on aktiivinen erittäin suurta pH-arvoa vastaan.

Toinen ominaisuus, joka erottuu proteinaasi K: ssa, on sen stabiilisuus korkeiden lämpötilojen (50 - 60 ° C) läsnä ollessa.

Entsymaattinen toiminta

Proteinaasi K vaatii kalsiumionin läsnäolon, vaikka tämä ei vaikuta sen aktiivisuuteen, jos sen stabiilisuuden ylläpitäminen on välttämätöntä.

Jotta proteinaasi K sulaisi substraatin kokonaan, on tarpeen noin 5 minuutin - 2 tunnin kosketusaika.

Tässä mielessä Daza et ai. Kuitenkin verrattiin saadun DNA: n puhtautta eri aikoina altistumisella proteinaasi K: lle ja päätteli, että pitkäaikainen inkubaatio (jopa 24 tuntiin) parantaa merkittävästi DNA: n laatua.

Eri protokolloissa käytetyn proteinaasi K -entsyymin pitoisuuteen nähden voidaan kuitenkin sanoa, että se on hyvin vaihteleva.

Sitä voidaan käyttää erittäin pienistä konsentraatioista (5 µg / ml) 500 µg / ml konsentraatioihin. Mutta yleisimmät työskentelypitoisuudet ovat välillä 50–100 μg / ml, etenkin proteiinien sulamisen ja nukleaasin inaktivoinnin yhteydessä. Vaikka kudosten käsittelyyn vaaditaan pitoisuus 2 mg / ml.

Sovellukset

Sen sovellukset ovat erittäin laajat ja voidaan tiivistää seuraavasti:

- Sitä käytetään proteiinien pilkkomiseen ja DNA: n uuttamiseen erilaisilla menetelmillä, kuten esimerkiksi: suolaaminen, PK-SDS, setyylitrimetyyliammoniumbromidi (CTAB), modifioitu kaliumasetaatti ja uuttaminen natriumjodidilla.

-Nukleaasien (RNaasit ja DNaasit) inaktivointi.

- In situ -hybridisaatiotekniikassa (HIS) nukleiinihapon vapautumisen helpottamiseksi, ei-toivottujen proteiinien poistamisen lisäksi.

- Proteiinien modifiointi.

-Tutkimuksen tasolla, erilaisissa tutkimuksissa.

Proteinaasi K: n edut

Useita vertailevia tutkimuksia on tehty proteinaasi K: ta käyttävien DNA-uuttamistekniikoiden välillä, muiden kanssa, jotka eivät käytä sitä, ja kaikki päättelevät, että entsyymin käytöstä on enemmän hyötyjä. Etuja ovat seuraavat:

Saadaan korkean molekyylipainon, korkealaatuinen ja puhdas DNA.

-Uutetu DNA on stabiili jopa 3 kuukautta.

Uutettua DNA: ta voidaan käyttää seuraavissa tekniikoissa: Southern blot, polymeraasiketjureaktio (PCR), elektroforeesi, mm.

Proteinaasi K -resistentit proteiinit

Eri tutkimuksissa on päätelty, että prionit (epänormaalit toksiset PrPSc-proteiinit) eroavat PrPC (luonnollisista) proteiineista resistentteinä proteinaasi K: n vaikutukselle, kun taas PrPC: t ovat herkkiä sen vaikutukselle.

Muut kirjoittajat ovat kuvanneet, että PrPSc: n rakenteessa on herkkiä osia ja muita proteinaasi K: lle resistenttejä osia. Molemmat osat ovat kuitenkin yhtä toksisia ja tarttuvia.

Toisaalta Bastian et al., 1987 eristettiin 4 proteiinia, joiden 28, 30, 66 ja 76 kda, Spiroplasma mirum -lajista. Kaikkien todettiin olevan vastustuskykyisiä proteinaasi K: n vaikutukselle ja niillä oli myös ristireaktio joidenkin prioonien kanssa.

Tiedetään, että tämä laji voi aiheuttaa kaihia ja merkittäviä neurologisia vaurioita, ja Bastianin tieteellisten havaintojen takia, muiden tutkimusten joukossa, tämä mikro-organismi on yritetty yhdistää tarttuviin spongiformisiin enkefalopatiaihin.

Tämän degeneratiivisen neurologisen patologian etiologia johtuu kuitenkin edelleen prioneista.

Tässä mielessä Butler ym. Tunnistivat ja karakterisoivat vuonna 1991 proteiini- luokkaa, joka vastasi proteinaasi K: ta 40 kda, kahdesta Mycoplasma hyorhinis -kannasta. Tämä taudinaiheuttaja vaikuttaa sioihin tartuttaen niiden kudoksiin, mutta tässä tapauksessa ei ollut ristireaktiota testattujen prioonien kanssa.

Lisää tutkimuksia tarvitaan monien tuntemattomien selvittämiseksi tässä suhteessa.

Viitteet

1. Bastian F, Jennings R ja Gardner W. 1987. Scrapiaan liittyvän fibrilliproteiinin antiseerumi ristireagoi Spiroplasma miru fibrilliproteiinien kanssa. J. Clin. Microbiol. 25: 2430 - 2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. DNA: n uutto- ja puhdistusmenetelmän arvioiminen tuntemattomien ruumiiden formaldehydi-kiinteässä lihaskudoksessa. Med Magazine, 2014; 22 (1): 42 - 49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, ja Mcgarrity G. Proteinaasi K -resistenttien proteiinien tunnistaminen ja karakterisointi luokan Mollicutes jäsenissä. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et ai. Kahden akseenisessa väliaineessa kasvatetun Trypanosoma cruzi DNA -uuttoprotokollan vertailu. Rev. Peru. Med. Exp. Kansanterveys 2014; 31 (2): 222 - 227. Saatavana osoitteessa: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E ja Palma W. Viiden DNA-uuttoprotokollan tehokkuuden määrittäminen parafinoidusta materiaalista molekyylitutkimuksia varten. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1): 10 - 19.