OKSIDAASIKOE: PERUSTEET, MENETELMÄ JA KÄYTÖT - BIOLOGIA - 2026

Oksidaasi testi on diagnostinen menetelmä, joka osoittaa läsnäolo entsyymin monimutkainen kutsutaan sytokromioksidaasi c. Tämä järjestelmä indusoi pelkistyneen sytokromin muuttumisen hapettuneeksi, koska se vangitsee happea ja tämä puolestaan ​​toimii viimeisenä elektroniakseptorina (H ⁺) hengitysketjussa.

Termi oksidaasi on lyhyt tapa viitata sytokromioksidaasientsyymiin, joka tunnetaan myös nimellä indofenolioksidaasi. Muinaisina aikoina uskottiin, että sytokromioksidaasin ja indofenolioksidaasin entsyymit olivat kaksi erilaista entsyymiä, mutta nykyään niiden tiedetään olevan samat.

Positiivinen ja negatiivinen oksidaasikoe. Lähde: Koneella luettavaa kirjailijaa ei toimitettu. Alpha.prim ~ commonswiki oletettu (perustuu tekijänoikeusvaatimuksiin).

Sytokromit ovat puolestaan ​​hemoproteiineja, jotka sisältävät rautaa ja täydentävät sytokromioksidaasijärjestelmää. Sytokromit voivat vaihdella lajeittain.

Sytokromeja on erilaisia ​​(sytokromit a1, a2, a3 ja 0). Jotkut bakteerit voivat tuottaa vain yhden, mutta toiset jopa kaksi tai kolme kerrallaan. Tässä mielessä sytokromien a ja a3 läsnäolo tunnetaan sytokromioksidaasina c. Tämä on sytokromityyppi, jonka oksidaasitesti havaitsee.

Neisseria- ja Pseudomonas-suvut sisältävät sytokromioksidaasin c. Nämä suvut antavat positiivisen oksidaasikokeen, joka auttaa erottamaan ne Acinetobacter- ja Stenotrophomonas-suvuista.

On myös muita sukuja, jotka ovat positiivisia oksidaasilla.

Perusta

Sytokromioksidaasi c -järjestelmän ominaisuudet

Sytokromioksidaasi-c-järjestelmä toimii seuraavasti: oksidaasipositiiviset mikro-organismit käyttävät happea energian tuottamiseen aerobisen hengityksen avulla. Tämä järjestelmä toimii, koska elektronit kulkeutuvat luovuttajista, kuten NADH ⁺, reseptoreihin, tässä tapauksessa happea.

Tämä johtaa energian (ATP) ja veden tai vetyperoksidin tuotantoon mikrokronomisen sytokromioksidaasijärjestelmästä riippuen.

Siksi suurin osa oksidaasipositiivisista bakteereista on myös katalaasipositiivisia, mikä on välttämätön edellytys tuotetun vetyperoksidin poistamiseksi, koska tämä aine on myrkyllinen bakteereille.

Sytokromioksidaasi-c-järjestelmää esiintyy joissakin aerobisissa bakteereissa, joissain fakultatiivisissa anaerobissa, harvoissa mikroaerofiilisissä bakteereissa ja ei tiukkoja anaerobia. Jälkimmäinen on ymmärrettävää, koska tiukat anaerobit eivät voi elää hapen läsnä ollessa, joten heistä puuttuu sytokromioksidaasijärjestelmä.

Testiperiaate

Tässä testissä se käyttää aineita, jotka toimivat keinotekoisin elektronin vastaanottajana, korvaamalla luonnolliset aineet elektronin kuljetusketjussa.

Käytetään pääasiassa väriaineita, kuten parafenyleenidiamiini ja indofenoli, jotka toimivat reseptorisubstraateina ja keinotekoisina elektroninluovuttajina.

Pafenyleenidiamiini hapetetaan sytokromioksidaasi c -järjestelmällä. Pelkistetyssä muodossa oleva väriaine on väritön, mutta hapettuneessa muodossaan värillinen.

Näin todistetaan sytokromioksidaasi c -järjestelmän läsnäolo; koska positiivinen reaktio tuottaa laventelin tai sinivihreän värin käytetystä reagenssista riippuen.

Toisaalta, jos viimeinen elektroneja hyväksyvä aine hengitysketjussa on erilainen kuin happi, oksidaasikoe on negatiivinen (värituottoa ei ole); tämä koskee anaerobisia mikro-organismeja.

Samoin, jos mikro-organismin käyttämä sytokromi on erilainen kuin sytokromioksidaasi c, se antaa myös negatiivisen testin.

Prosessi

Oksidaasitestiä varten on olemassa useita reagensseja ja protokollia, kaikki samaan tarkoitukseen.

reagenssit

Kovacs-reagenssi, Gordon- ja McLeod-reagenssi, Nadi-reagenssi, Carpenter, Suhrland ja Morrison-reagenssi ja oksidaasilevyjen käyttö.

-Kovacs-oksidaasireagenssi

Se koostuu 1% tetrametyyli-p-fenyleenidiamiinidihydrokloridista.

Kovacsin reagenssi valmistetaan liuottamalla 1 g edellä mainittua ainetta 50 ml: aan tislattua vettä. Se kuumennetaan hienovaraisesti, kunnes se on täysin liuennut. Siirretään riittävän tilavaan keltaiseen keltaiseen pulloon ja täytetään tilavuus 100 millilitraan tislatulla vedellä. Odota vähintään 15 minuuttia ennen käyttöä. Säilytä jääkaapissa valolta suojattuna.

Se on merkitty Kovacs-oksidaasireagenssilla erottamaan se Kovacs-reagenssista, jota käytettiin indolikokeen paljastamiseksi. Tämä reagenssi on herkin, vähemmän myrkyllinen, mutta kalliimpi kuin muut reagenssit.

Positiivinen reaktio ilmenee tällä reagenssilla, kun pesäkkeen väri muuttuu lavenderiksi, joka muuttuu nopeasti violetiksi melkein mustaksi. Negatiivinen reaktio on ilmeinen, koska pesäkkeessä ei ole värinmuutosta tai se saa lievän vaaleanpunaisen värin. Väliaine voi myös tummua, mutta se ei tarkoita positiivista reaktiota.

Tällä reagenssilla reaktioaika on ratkaiseva, värinmuutosta, joka tapahtuu välillä 5 - 15 sekuntia, pidetään positiivisena reaktiona.

-Gordon ja McLeod-reagenssi

Se koostuu dimetyyli-p-fenyleenidiamiinidihydrokloridista, joka tunnetaan myös nimellä N-dimetyyli-p-fenyleenidiamiini tai p-aminodimetyyli-aniliinimonohydrokloridi. Se valmistetaan Kovacs-oksidaasireagenssille kuvatulla tavalla korvaamalla mukana oleva aine.

Tämä reagenssi on hiukan vakaampi kuin Kovacs-oksidaasireagenssi, vaikka kaikki reagenssit, jotka sisältävät p-fenyleenidiamiinia, ovat epävakaita.

Tämä reaktio on myöhemmin, se tulkitaan positiiviseksi, kun sininen-violetti väri ilmenee 10 - 30 minuutissa.

-Nadi-reagenssi

Se koostuu 1% a-naftyylista etyylialkoholissa (95% etanolia) ja 1% aminodimetyyli-aniliinista. Seos valmistetaan yhtä suurena määränä ja käyttämällä laimennusaineena absoluuttista etyylialkoholia, kunnes täytetään riittävä määrä 100 ml: aan.

- Puusepän, ​​Suhrlandin ja Morrisonin reagenssi

Se koostuu 1% p-aminodimetyylialaniinioksalaatista. Valmista samalla tavalla kuin Kovacs-oksidaasireagenssille on kuvattu, vaihtamalla vastaavaan aineeseen.

Kun liuos on valmis, koeliuskat valmistetaan seuraavasti: 6-8 cm: n Whatman nro 1 -suodatinpaperinauhat kyllästetään 1% dimetyyli-p-fenyleenidiamiinioksalaattireagenssilla.

Niiden annetaan kuivua kosketuksessa metallin kanssa, varastoidaan kuivatusainetta sisältävissä ruuvissa suljetuissa purkeissa ja säilytetään jääkaapissa. Nämä nauhat ovat stabiileja jopa 6 kuukautta.

Se on vakaisin reagenssi kaikista mainituista, ja se voi kestää jopa 6 kuukautta liuoksessa. Toinen pluskohta on se, että se ei värjää väliainetta pesäkkeen ympärillä, jos sitä käytetään suoraan levyllä.

Punaisen värin ilme tulkitaan positiiviseksi testiksi.

-Oksidaasilevyt

Ne ovat kaupallisia levyjä, jotka on kyllästetty reagenssilla oksidaasikoetta varten. Markkinoilla on useita kaupallisia merkkejä.

Sen käyttö on varsin käytännöllistä, koska ei ole tarpeen valmistaa tuoreita reagensseja, mikä helpottaa työtä. Saadut tulokset ovat luotettavia niin kauan kuin levyt säilytetään oikein.

protokollat

Suora levymenetelmä, epäsuora menetelmä paperilla ja oksidaasireagensseilla kyllästettyjen kiekkojen käyttö.

-Suora aluksella menetelmä

2 tai 3 tippaa mitä tahansa edellä mainituista reagensseista lisätään tätä tarkoitusta varten suoraan pesäkkeeseen / pesäkkeisiin, jotka ovat kasvatusalustan levyllä, joka ei sisällä glukoosia.

Pesäkkeiden värin muutosta tai muuttumista tulkitaan, ei väliaineen. Voimassa oleva reaktioaika riippuu käytetystä reagenssista.

-Epäsuora menetelmä paperilla

Leikkaa pala suodatinpaperia (Whatman nro 1) kooltaan 6 cm ² ja aseta se tyhjän Petri-astian sisään.

Lisää 2 tai 3 tippaa Kovacs-oksidaasireagenssia paperiin, ota osa tutkittavaan pesäkkeeseen platinakahvalla tai puisella hammastikulla ja levitä se suorassa linjassa reagenssilla kyllästetylle paperille. Tulkkaa 5–10 sekunnissa.

Carpenter-, Suhrland- ja Morrison-reagenssilla valmistetuilla liuskoilla pesäke levitetään kuivalle liuskalle. Yhden liuskan avulla testataan useita kantoja. Tulkkaa 10 sekunnissa

-Levyt (m

Kostuta kaupalliset levyt hienovaraisesti steriilillä tislatulla vedellä ja levitä tutkittava pesäke päälle. Levyjä suositellaan käytettäväksi 35 ° C: ssa, jos käytetään levyjä huoneenlämpötilassa tai jäähdytettyjä levyjä, reaktio on hiukan hitaampi. Tulkitse värimuutos välillä 10 - 20 sekuntia.

Veren tai suklaagarin sisältämiä pesäkkeitä voidaan käyttää.

-Levyt (epäsuora menetelmä)

Kostuta levy aikaisemmin kuvatulla tavalla. Aseta se tyhjään Petri-astiaan. Ota riittävä määrä pesäkettä tutkiaksi platinakahvalla tai puisella hammastikulla ja aseta levylle. Tulkitse värimuutos välillä 10 - 20 sekuntia.

Käyttää

Neisseria-suku ja Acinetobacter-suku ovat toisinaan morfologisesti hyvin samankaltaisia, koska vaikka Acinetobacter-suku on gram-negatiivinen sauva, se voi joskus olla kokkoidimuodossa ja levittää pareittain, jäljittelemällä sukua Neisseria.

Tässä tapauksessa oksidaasikoe on todella hyödyllinen. Neisseria-suku on positiivinen ja Acinetobacter-negatiivinen.

Moraxella-suku on kuitenkin hyvin samanlainen kuin Neisseria-suku, ja molemmat antavat positiivisen reaktion; Siksi hiilihydraattifermentaatiokokeet on aina suoritettava lopullista tunnistamista varten.

Toisaalta, oksidaasikoe on hyödyllinen erottamaan Enterobacteriaceae-perheeseen kuuluva bakteeri (kaikki oksidaasinegatiiviset) muista fermentaatioista, kuten sukuista Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oksidaasipositiivinen).

Vibrio- ja Helicobacter-suvut ovat myös oksidaasipositiivisia.

QA

Käytä tunnettuja Escherichia coli -kantoja negatiivisena kontrollina ja Pseudomonas aeruginosa -kantoja positiivisena kontrollina.

rajoitukset

-Ragenssit on käytettävä vasta valmistettuina, niiden säilyvyysaika liuoksessa huoneenlämpötilassa on lyhyt, koska ne ovat erittäin epävakaita. Jäähdytettyinä ne voivat kestää 5 päivästä 2 viikkoon.

-Ragenssit ovat värittömiä, jos ne muuttavat väriä, ne on hävitettävä. Vaurioituneet levyt näkyvät, koska ne tummuvat ajan myötä.

- Positiivista reaktiota Kovacs-oksidaasireagenssin kanssa välillä 15-60 sek pidetään viivästyneenä reaktiona ja 60 sekunnin kuluttua sitä pidetään negatiivisena.

-Haemophylus influenzae antaa negatiivisen oksidaasireaktion, jos käytetään reagenssia dimetyyli-p-fenyleenidiamiinin kanssa, mutta positiivinen, jos käytetään Kovacs-oksidaasireagenssia (tetrametyyli-p-fenyleenidiamiini).

-Mediumit, jotka sisältävät glukoosia, häiritsevät testiä ja antavat vääriä negatiivisia.

-Bordetella pertussis -kannat voivat antaa väärän positiivisen reaktion, jos ne ovat peräisin erittäin tiivistetyistä veriagarmaljoista.

-Metallisten (rauta) kahvojen käyttö antaa väärän positiivisen reaktion.

suosituksia

- Koska reagenssit ovat erittäin epävakaita ja yleensä hapettuvat, on suositeltavaa jäädyttää 1-2 ml: n erät ja poistaa tarvittaessa.

- Toinen tapa viivyttää reagenssin automaattista hapettumista on lisätä 0,1% askorbiinihappoa reagensseja valmistettaessa.

- Koska reagenssit ovat epävakaita, suositellaan viikoittaista laadunvalvontaa.

-Ragensseja, jotka eivät läpäise laadunvalvontatestiä, ei tule käyttää.

Viitteet

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5. toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott: n mikrobiologinen diagnoosi. 12 toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
3. "Oksidaasitesti." Wikipedia, ilmainen tietosanakirja. 15. tammikuuta 2018, 10:32 UTC. 3. huhtikuuta 2019, 14:03
4. Maailman terveysjärjestö. Laboratorio-opas kansanterveyden kannalta tärkeiden bakteeripatogeenien mikrobilääkeresistenssin tunnistamiseksi ja testaamiseksi kehitysmaissa, 2004. Saatavana osoitteessa who.int/drugresistance/infosharing
5. Reagenssinauhat bakteerien oksidaasiaktiivisuuden diagnosoimiseksi. Rev Cubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150 - 151.