DNA-SEKVENSOINTI: MAXAM-GILBERT, MENETELMÄ JA ESIMERKIT - BIOLOGIA - 2026

DNA-sekvensointi (deoksiribonukleiinihappo) on menettely, molekyylibiologian laboratorioissa, jonka avulla on tietää nukleotidien järjestys geneettisen materiaalin kiinnostavia. Lisäksi RNA: n (ribonukleiinihapon) sekvensointi voidaan myös paljastaa.

Tämä tekniikka on ollut välttämätön biologisten tieteiden kehittämisessä. Sitä voidaan soveltaa myös muihin tietoalueisiin - kuten esimerkiksi lääketieteelliseen diagnoosiin ja oikeuslääketutkimuksiin.

Lähde: pixabay.com

Aikaisemmin DNA-juosteen sekvensointia pidettiin hitaana ja kalliina aktiivisuutena, mikä salli vain muutaman emäsparin tunnistamisen oligonukleotideissa.

Nykyään, kaikilla tieteen edistyksillä, DNA-sekvensointi on rutiinitoimi monissa laboratorioissa ympäri maailmaa, lähes 50 vuoden tutkimuksen ansiosta tällä alalla. Ketjun pituuden kannalta jopa miljoonat emäsparit voidaan sekvensoida hyvin lyhyessä ajassa.

Tätä varten on kehitetty kymmeniä tekniikoita, joiden hinta ja tarkkuus vaihtelevat. Tässä artikkelissa kuvaamme sekä klassista että modernia tekniikkaa, jokaisella on edut ja haitat.

Tähän asti sekvensointitekniikat mahdollistavat täydellisten genomien sekvenssin saamisen pienistä prokaryooteista ja hiivoista ihmisen genomiin.

DNA-rakenne

DNA-sekvensointiin käytettyjen menetelmien ja tekniikoiden ymmärtämiseksi on välttämätöntä tietää tietyt molekyylin rakenteen ja koostumuksen avainkysymykset.

DNA on biomolekyyli, jota löytyy kaikista elävistä esineistä, bakteereista suuriin vesieläimiin. Organellien - kuten mitokondrioiden ja kloroplastien - sisällä on pyöreä DNA-molekyyli. Joissakin viruksissakin löydetty geneettinen aine on DNA.

Rakenteellisesti DNA on nukleotidien kokoelma. Jokainen niistä koostuu hiilihydraatista, typpipitoisesta emäksestä (A, T, C tai G) ja fosfaattiryhmästä. DNA-sekvensoinnin tavoitteena on paljastaa järjestys, jossa neljä typpipitoista emästä löytyvät sekvenssistä.

Historia

1950-luvun puolivälissä tutkijat Watson ja Crick kuvasivat DNA: n rakenteen käyttämällä krologologisia tekniikoita. Kukaan näistä tutkijoista ei kuitenkaan ollut löytänyt tapaa purkaa sekvenssi.

Vaikka oli olemassa tiettyjä edeltäjiä, tärkein tapahtuma oli Sanger-menetelmän luominen, vuonna 1977. Menetelmän isä Frederick Sanger oli brittiläinen biokemialainen, voittanut kaksi Nobel-palkintoa valtavasta panoksestaan ​​biotieteisiin.

Tämä tekniikka tunnetaan myös kirjallisuudessa nimellä "ketjun terminaatio" tai dideoksinukleotidit. Seuraavassa kuvataan tämän tekniikan ja sen parantamisen ja innovaatioiden perusteella kehitetyt periaatteet.

Sanger-menetelmä

Sanger-menetelmän kehittäminen edusti ratkaisevaa tapahtumaa molekyylibiologiassa. Se sisältää solun normaalisti tapahtuvan DNA-replikaatioprosessin peruskomponentit, mutta lisäämällä erityisen komponentin: dideoksinukleotidit.

Reaktion pääkomponentit

- DNA-polymeraasi: DNA-polymeraasientsyymi on prosessin tärkeä osa. Tämä molekyyli osallistuu DNA-juosteen replikaatioon ja sen tehtävänä on uuden juosteen synteesi, parin muodostaen trifosfaattideoksiribonukleotidit komplementaaristen kanssa.

Muista, että DNA: ssa tymiinit (T) parittuvat adeniinien (A) kanssa kahden vety sidoksen kautta, kun taas sytosiini (C) tekee niin guaniinin (G) kanssa kolmen sidoksen kautta.

- Nukleotidit: Sanger-sekvensointi sisältää kahden tyyppisiä nukleotideja, neljä 2'-deoksinukleotidia (lyhennettynä dATP, dGTP, dCTP ja dTTP) ja neljä dideoksinukleotidia (ddATP, ddGTP, ddCTP ja ddTTP).

Vaikka dideoksinukleotidit ovat samanlaisia ​​kuin monomeerit, jotka normaalisti sisällytetään DNA: han, niiden rakenteessa puuttuu -OH-ryhmä. Tämän vuoksi on mahdotonta lisätä uutta nukleotidia ketjuun.

Siksi, kun erityinen nukleotidi lisätään - täysin satunnaisella tavalla - muodostuvaan ketjuun, synteesi halvaantuu. Siksi reaktion lopussa on erikokoisia ketjuja, joista jokaisessa reaktio pysäytettiin eri pisteessä.

Kokeellisesti valmistetaan neljä testiä. Jokainen sisältää kiinnostuksen kohteena olevasta biologisesta näytteestä uutetun DNA: n, normaalit nukleotidit ja yhden neljästä erityisestä nukleotidityypistä. Joko erityiset nukleotidit on merkitty jonkin tyyppisellä fluoresoivalla markkerilla (ks. Automaattinen sekvensointi alla).

Tulosten lukeminen

Ensimmäinen vaihe on erottaa kaikki syntetisoidut ketjut niiden koon mukaan. Jotkut ovat pidempiä kuin toiset riippuen siitä, mihin erityiset tukikohdat sisällytettiin.

On olemassa erilaisia ​​biokemiallisia tekniikoita, jotka sallivat seoksen komponenttien erottamisen käyttämällä kokoa syrjivänä ominaisuutena. Sangerin menetelmässä eri ketjut erotetaan elektroforeesilla. Tekniikan hienostuneemmissa muunnelmissa käytetään kapillaarielektroforeesia.

Siten pitkät säikeet kulkevat vähemmän kuin lyhyemmät variantit. Tämän jälkeen järjestelmä käy läpi lukijan, joka tunnistaa jokaiseen dideoksinukleotidiin sisältyvän merkkiaineen. Tällä tavalla sekvenssien järjestys voidaan tietää.

Tämä "ensimmäisen sukupolven" tekniikka pystyy lukemaan enintään 1 kiloemäksen suuruiset DNA-fragmentit. Tällä hetkellä Sanger-menetelmää käytetään useissa laboratorioissa, yleensä sen nykyisissä muunnelmissa. Lisäksi sitä käytetään vahvistamaan tulokset, jotka on saatu monimutkaisimmilla tekniikoilla - mutta vähemmän tarkalla.

Automaattinen sekvensointi

Kun sekvensointia vaaditaan laajassa mittakaavassa, prosessia nopeutetaan automatisoinnin avulla. Tämä on muunnelma Sanger-ketjun lopetusmenetelmästä, jossa alukkeet leimataan fluoresoivilla tuotteilla niiden erottamiseksi.

Seuraavaksi reaktiotuotetta ajetaan elektroforeesissa - kaikki yhdellä kaistalla. Koska jokainen fragmentti poistuu geelin viimeisestä osasta, se tunnistetaan nopeasti sen fluoresoivalla leimalla, virheellä, joka on noin 1%.

Kehittyneimmissä järjestelmissä on jopa 96 kapillaariputken järjestelmä, jota hallinnoi robotti kytketty tietokone. Eli 96 DNA-näytettä voidaan testata samanaikaisesti. Siten elektroforeesiin ja tulosten analysointiin liittyvä prosessi on täysin automatisoitu.

Yhdessä päivässä nämä järjestelmät voivat järjestää jopa 550 000 emästä. Prosessin aikana ihmisen työ on tarpeetonta, menetelmän aloittaminen vie vain noin 15 minuuttia.

Maxam-Gilbert-sekvensointi

Samaan aikaan kun Sanger julkaisi työtään, kaksi tutkijaa nimeltä Allan Maxan ja Walter Gilbert onnistuivat kehittämään uuden menetelmän DNA-sekvenssin saamiseksi. Menetelmä saavutti suosiota tuolloin, mutta myöhemmin sen syrjäytettiin parantamalla Sangerin menetelmää.

Toisin kuin Sanger-menetelmä, Maxanin ja Gilbertin sekvensointi (tai kemiallinen sekvensointi, kuten se myös tiedetään) ei sisällä hybridisaatioreaktioita. Menetelmä koostuu merkinnöistä reaktiivisilla aineilla toisessa päässä, jota seuraa puhdistusprosessi.

Yksi tämän tekniikan kielteisistä puolista on sen valtava monimutkaisuus ja käyttäjälle vaarallisten kemikaalien käyttö. Kemialliset tauot saadaan aikaan levittämällä DMS, muurahaishappoa, hydratsiinia ja hydratsiinia suolojen kanssa.

Prosessi

Protokolla alkaa merkinnöistä juosteen 5'-päässä fosforimarkkerilla 32, sitten tapahtuu typpiemäksen kemiallinen modifikaatio ja se erotetaan. Lopuksi tapahtuu abasisen alueen pilkkoutuminen.

Ensin lyhennetään jaettava merkkijono pienemmiksi segmenteiksi. Tämä vaihe suoritetaan restriktioentsyymeillä, jotka johtavat ulkoneviin päihin.

Seuraavaksi reaktio suoritetaan alkalisella fosfataasilla, jonka tarkoituksena on eliminoida fosfaattiryhmä. Siten polynukleotidikinaasia voidaan käyttää leimaamisen suorittamiseen.

Ketju denaturoituu (kaksi säiettä auki). Sitten kemikaalit levitetään. Nämä pilkkoutumisreaktiot suoritetaan hallitusti ja on tiedossa, minkä tyyppiset sidokset kukin levitetty kemikaali hajoavat.

Tulosten lukeminen

Kuten Sanger-menetelmässä, tulosten lukeminen käsittää elektroforeesijärjestelmässä saatujen ketjujen erottamisen koon mukaan. Polyakryyliamidista koostuvat järjestelmät mahdollistavat erittäin riittävän resoluution saavuttamisen geelin lukemiseksi.

Massasekvensointi

Massiivinen sekvensointi käsittää sarjan uusia menetelmiä, lyhennettynä NGS, englanniksi “Next Generation Sequencing”.

NGS: ksi luokitellut menetelmät vaativat aikaisemman DNA-monistusvaiheen (ne eivät toimi yhden molekyylin kanssa). Lisäksi käytettävät alustat vaihtelevat suuresti. Seuraavassa kuvataan suosituimpien menetelmien periaatteet:

pyrosekvensointi

Siihen kuuluu pyrofosfaatin vapautumisen tarkkailu, joka tapahtuu joka kerta kun uusi nukleotidi lisätään DNA-juosteeseen. Entsyymijärjestelmä on kytketty toisiinsa siten, että valon säteily (joka voidaan havaita kameralla) tapahtuu joka kerta kun uusi nukleotidi sisällytetään.

Prosessi alkaa kunkin typpiemäksen erillisellä inkuboinnilla sen valvomiseksi, onko valonemissiota vai ei. Pyrosekvensointi voi lukea pitkiä juosteita, mutta löydetty virhesuhde on korkea.

Synteesisekvensointi

Tähän sisältyy leimattujen nukleotidien sisällyttäminen. Nämä fluoresoivat komponentit lisätään, pestään ja sisällytetty nukleotidi merkitään. Sitten nukleotidileima poistetaan, ja juosteen synteesi voi jatkua. Seuraavaan vaiheeseen sisällytetään myös leimattu nukleotidi, ja edellä mainitut vaiheet toistetaan.

Haitta tällä tekniikalla tapahtuu, kun fluoresoivia markkereita ei ole poistettu kokonaan. Nämä päästöt luovat taustavirheitä, mikä johtaa merkittäviin virheisiin.

Ligaatiosekvensointi

Tämä tekniikka eroaa muista, koska siinä ei käytetä DNA-polymeraasia. Sen sijaan tämän menetelmän avainentsyymi on ligaasi. Tässä käytetään fluoresoivasti leimattuja DNA-fragmentteja, entsyymi yhdistää sen ja se havaitaan.

Tämän tekniikan suurin ongelma on lyhyt fragmentinpituus, jota se pystyy käsittelemään.

Ion Torrent -sekvensointi

Tämä tekniikka perustuu H ⁺ -ionin mittaukseen, joka vapautuu joka kerta kun uusi nukleotidi sisällytetään. Periaate on melko samanlainen kuin pyrosekvensointi, mutta paljon halvempi.

esimerkit

Ihmisen genomin sekvensointi

Ihmisen perimän sekvensointi on ollut yksi biologian lupaavimmista haasteista, samoin kuin yksi tieteen historian suosituimmista kilpailuista. Itse asiassa genomin sekvensoinnista tuli projektiin osallistuville tutkijoille kilpailu.

Vuonna 1990 hän aloitti kutsutun "ihmisgenomiprojektin", jota johti kuuluisa tiedemies, Nobel-palkinnon voittaja James Watson. Vuoden kuluttua, vuonna 1991, Venter ottaa haasteen "lyödä" Watsonia ja sekvensoida hänen edessään oleva genomi. Kuitenkin vuonna 1992 Watson jäi eläkkeelle ja toinen tutkija otti käskyn.

Vuonna 1995 Venter ilmoitti menestyksestään bakteerigenomin täydellisessä sekvensoinnissa satunnaisella sekvensointimenetelmällä. Samoin vastapuoli ilmoitti vuotta myöhemmin hiivagenomin sekvensoinnista.

Vuonna 2000 tutkinto päättyi. Molemmat yritykset julkaisivat alustavan koko genomituloksensa kahdessa tieteen arvostetuimmassa lehdessä: Luonto ja Tiede.

Tutkijat jatkoivat kuitenkin ehdotusten parantamista, ja vuonna 2006 valmistettiin tiettyjen ihmisen kromosomien sekvenssit.

Tärkeys ja sovellukset

Tällaisen tärkeän molekyylin, kuten DNA: n, nukleotidien järjestyksen tunteminen on arvokasta biologille ja siihen liittyville ammattilaisille. Tämä polynukleotidiketju sisältää kaiken tarvittavan tiedon kaikenlaisten elämänmuotojen kehittämiseksi ja ylläpitämiseksi.

Näistä syistä tämän sekvenssin tuntemus on välttämätöntä biologiselle tutkimukselle. Periaatteessa sekvensointi mahdollistaa biologisten järjestelmien yhden tärkeimpien ominaisuuksien mittaamisen ja niiden välisten erojen määrittämisen.

Taksonomistit ja systemaatikot käyttävät sekvensointia laajalti, koska tietyt DNA-sekvenssit mahdollistavat kriteerien määrittämisen, jotta voidaan päätellä, kuuluvatko kaksi organismia samaan lajiin, sen lisäksi, että ne voivat ehdottaa hypoteeseja niiden välisistä fylogeneettisistä suhteista.

Lisäksi DNA-sekvensoinnilla on sovelluksia lääketieteessä ja diagnostiikassa. Esimerkiksi on edullisia ja helposti saavutettavissa olevia järjestelmiä, jotka sekvensoinnin avulla mahdollistavat arvioinnin taipumuksesta kehittää tiettyjä sairauksia (kuten syöpää) käyttämällä ns. Yhden nukleotidin polymorfismeja (SNP).

Rikollisten ja rikosteknisten tutkimusten lisäksi on rikastutettu sekvensointitekniikoilla, joita voidaan käyttää luotettavana todisteena tietyn henkilön osallistumisesta rikokseen.

Viitteet

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). Sekvenssierit: sekvensoivan DNA: n historia. Genomiikka, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK ja Mardis, ER (2013). Seuraavan sukupolven sekvensointivallankumous ja sen vaikutus genomiikkaan. Cell, 155 (1), 27 - 38.
3. Levy, J. (2010). Tieteellinen kilpailu. Galileosta ihmisgenomiprojektiin. Toimituksellinen Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, AR (1977). DNA-sekvensointi ketjun päättävillä inhibiittoreilla. Kansallisen tiedeakatemian julkaisut, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Seuraavan sukupolven sekvensointi muuttaa nykypäivän biologiaa. Luontomenetelmät, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (toim.). (2014). Seuraavan sukupolven sekvensointi. Caister Academic Press.