GIEMSA-TAHRA: PERUSTEET, MATERIAALIT, TEKNIIKKA JA KÄYTTÖTAVAT - BIOLOGIA - 2026

Giemsa värillä, on eräänlainen värjäys kliinisissä näytteissä, joka perustuu seokseen, jossa oli happoa ja emäksiset värit. Sen luominen oli innoittamana Romanowsky tekemästä työstä, jossa kemisti ja bakteriologi Gustav Giemsa, joka oli alun perin saksalainen, paransi sitä lisäämällä glyserolia stabiloimaan yhdisteitä.

Alkuperäiseen Romanowsky-tekniikkaan luodut muutokset antoivat huomattavasti parannuksia mikroskooppisista havainnoista, siksi tekniikka kastettiin Giemsa-värjäysnimellä.

Erilaiset näytteet värjättiin Giemsa-värjäyksellä. A. Trypanosoma evansi ääreisveressä. B. Normaalit verisolut. C. Borrelia theileri ääreisveressä. D. Burkittin lymfooma.

Koska suorittaminen on yksinkertainen, erittäin toimiva ja taloudellinen tekniikka, sitä käytetään nykyään laajalti kliinisessä laboratoriossa hematologisten levien, luuytimenäytteiden ja kudosleikkeiden valmistukseen.

Giemsa-värjäystekniikka on erittäin hyödyllinen sytologisissa tutkimuksissa, koska se mahdollistaa spesifisten solurakenteiden havaitsemisen. Tämä tekniikka värjää solujen sytoplasmat, ytimet, nukleolit, vakuolit ja rakeet, kykeneen erottamaan kromatiinin pienetkin jäljet.

Lisäksi voidaan havaita merkittävät muutokset ytimen koosta, muodosta tai värimuodosta, missä on mahdollista visualisoida ytimen ja sytoplasman välisen suhteen menetykset.

Toisaalta se sallii luuytimen ja ääreisveren epäkypsien solujen tunnistamisen, koska se on tärkeä vakavien sairauksien, kuten leukemian, diagnosoinnissa. On myös mahdollista havaita mm. Hemoparasiitit, ylimääräiset ja solunsisäiset bakteerit, sienet.

Sytogenetiikassa sitä käytetään laajasti, koska solujen mitoosia on mahdollista tutkia.

Giemsa-värjäyksen perusteet

Romanowsky-tyyppiset väriaineet perustuvat kontrastin käyttöön happamien ja emäksisten väriaineiden välillä emäksisen ja happorakenteen värjäämiseksi. Kuten voidaan nähdä, happoväreillä on affiniteetti emäksisten rakenteiden värjäämiseen ja päinvastoin.

Käytetty emäksinen väriaine on metyleenisininen ja sen hapettuneet johdannaiset (Azure A ja Azure B), kun taas happoväri on eosiini.

Solujen happorakenteet ovat nukleiinihappoja, segmentoitujen basofiilien rakeita, muun muassa, siksi ne värjätään metyleenisinisellä.

Samassa mielessä solujen perusrakenteet ovat muun muassa hemoglobiini ja jotkut rakeet, kuten sellaiset, jotka sisältyvät segmentoituihin eosinofiileihin; nämä värjätään eosiinilla.

Toisaalta johtuen siitä tosiseikasta, että metyleenisiniselle ja taivaansiniselle on ominaista metakromaattiset väriaineet, ne voivat antaa vaihtelevan sävyn eri rakenteille niiden hallussa olevien polyanionien kuormituksen mukaan.

Näin strateginen emäksisten ja happovärien yhdistelmä onnistuu kehittämään laajan värispektrin kunkin rakenteen biokemiallisten ominaisuuksien mukaan kulkemalla vaaleansinisen, tummansinisen, lila- ja violetin sävyjen läpi happorakenteiden tapauksessa.

Vaikka eosiinin tarjoama väri on vakaampaa, se tuottaa värejä punertavanoranssin ja lohen välillä.

tarvikkeet

Materiaalit varastoliuoksen valmistamiseksi

Varastoliuoksen valmistelu vaatii punnitsemisen 600 mg jauhemaista Giemsa-värjäystä, mittauksena 500 cc asetonia sisältämätöntä metyylialkoholia ja 50 cc neutraalia glyseriiniä.

Kuinka valmistaa kantaliuos

Aseta raskas Giemsa-jauhe laastiin. Jos niistä on kokkareita, ne tulisi ruiskuttaa. Lisää sen jälkeen huomattava määrä mitattua glyseriiniä ja sekoita hyvin. Saatu seos kaadetaan erittäin puhtaan meripihkan pulloon.

Loput glyseriini asetetaan laasti. Sekoita uudelleen puhdistaaksesi loput väriaineesta, joka on juuttunut laastin seiniin, ja kaada samaan purkkiin.

Pullo suljetaan ja asetetaan vesihauteeseen 55 ° C: seen 2 tunniksi. Ravista seosta varovasti noin puolen tunnin välein, kun se on vesihauteessa.

Seuraavaksi seoksen annetaan jäähtyä alkoholin asettamiseksi. Aiemmin osa mitatusta alkoholista asetetaan laastissa jäljellä olevan väriaineen pesun lopettamiseksi ja sitten se lisätään seokseen yhdessä muun alkoholin kanssa.

Tämän valmisteen tulisi antaa kypsyä vähintään 2 viikkoa. Käytetty osa varastoliuoksesta tulisi suodattaa.

Valmisteen kontaminaation välttämiseksi on suositeltavaa siirtää jatkuvan käytön osuus pieneen meripihkan pulloon, jossa on tiputin. Täytä joka kerta, kun reagenssi loppuu.

Materiaalit puskuriliuoksen valmistamiseksi

Toisaalta puskuriliuos, jonka pH on 7,2, valmistetaan seuraavasti:

6,77 g natriumfosfaattia (vedetön) (NaHPO ₄), 2,59 g kaliumdivetyfosfaattia (KH ₂ PO ₄) ja tislattua vettä punnitaan 1000 cc.

Väriaineen lopullinen valmistelu

Lopullisen värjäysliuoksen valmistamiseksi mitataan 2 ml suodatettua kantaliuosta ja sekoitetaan 6 ml: n kanssa puskuriliuosta. Sekoita seos.

Asiaankuuluva tosiasia, joka on otettava huomioon, on se, että värityksenvalmistustekniikat voivat muuttua riippuen kaupallisesta yrityksestä.

Lisäaineet tarvitaan värityksen suorittamiseen

Kuvaillujen materiaalien lisäksi sinulla on oltava värisiltoja, veden tai puskurin sisältäviä t-paitoja pesemiseen, esineiden dioja tai esineiden suojaa, sekuntikelloa väriaikojen hallitsemiseksi ja tahraamista paperia tai jotain muuta materiaalia, jota voidaan käyttää kuivumiseen (sideharso tai puuvilla).

Tekniikka

Värjäysprosessi

1) Ennen värjäämistä näytteen kerroksen on oltava valmis puhtaalle levylle.

Näytteet voivat olla veri-, luuytimen, histologisten kudosleikkeiden tai kohdunkaula-emättimen näytteitä. On suositeltavaa, että levitteet ovat ohuita ja kuivataan 1 tai 2 tuntia ennen värjäystä.

2) Aseta kaikki värjättävät arkit värisillalle. Työskentelet aina samassa järjestyksessä ja jokainen arkki on hyvin tunnistettu.

3) Aseta muutama tippa 100-prosenttista metyylialkoholia (metanolia) uppoon ja anna sen toimia 3 - 5 minuuttia näytteen kiinnittämiseksi ja dehydratoimiseksi.

4) Hävitä levyllä oleva metanoli ja anna sen kuivua.

5) Kun kuiva, aseta lopullinen väriliuos liuottimella, kunnes koko arkki on peitetty. Anna vaikuttaa 15 minuuttia. Jotkut kirjoittajat suosittelevat enintään 25 minuuttia. Se riippuu liiketalosta.

6) Tyhjennä tahra ja pese tahri tislatulla vedellä tai 7,2-puskuriliuoksella.

7) Anna levityspaperille kuivua ulkona, pystysuunnassa tuen avulla.

8) Puhdista liuskan takaosa alkoholipyyhkeellä tai vanupuikolla, jotta tahrat jäävät pois.

apuohjelmia

Giemsa-värjäystekniikkaa käytetään monilla alueilla, mukaan lukien: hematologia, mykologia, bakteriologia, parasitologia, sytologia ja sytogenetiikka.

hematologian

Se on yleisintä käyttöä tälle tahralle. Sen avulla jokainen luuytimen tai perifeerisen verinäytteen läsnä oleva solu voidaan tunnistaa. Sen lisäksi, että arvioidaan kunkin sarjan lukumäärä, pystytään havaitsemaan leukosytoosi tai leukopenia, trombosytopenia jne.

Koska se on herkkä tunnistamaan epäkypsiä soluja, sillä on merkitystä akuutin tai kroonisen leukemian diagnoosissa. On myös mahdollista diagnosoida anemia, kuten sirppisoluanemia, sirppisolu, mm.

mykologia

Tällä alueella sen käyttö on yleistä Histoplasma capsulatum (solunsisäinen dimorfinen sieni) -hakua varten kudosnäytteistä.

bakteerioppi

Giemsa-värjäytyneissä hematologisissa leikkeissä on mahdollista havaita Borrelias sp -potilaat, joilla esiintyy toistuvan kuumeen kutsuttua tautia. Spiroskeeteja on runsaasti punasoluissa näytteissä, jotka on otettu kuumetta huipussa.

On myös mahdollista visualisoida solunsisäiset bakteerit, kuten Rickettsia sp ja Chlamydia trachomatis, tartunnan saaneissa soluissa.

parasitologia

Parasitologian alalla Giemsa-värjäys on mahdollistanut diagnoosin loistaudit, kuten malaria, Chagas-tauti ja leishmaniasis.

Kahdessa ensimmäisessä Plasmodium sp- ja Trypanosoma cruzi -parasiitit voidaan nähdä tartunnan saaneiden potilaiden ääreisveressä. Niitä voidaan löytää eri vaiheissa taudin vaiheesta riippuen.

Veren loisten etsinnän parantamiseksi on suositeltavaa käyttää Giemsa-tahraa sekoitettuna May-Grünwald -värjäykseen.

Samoin ihon leishmaniaasi voidaan diagnosoida arvioimalla Giemsa-värjättyjä ihon biopsianäytteitä, joista loista löytyy.

soluoppi

Giemsa-värjäystä käytetään myös endoservikiaalisten näytteiden sytologiseen tutkimukseen, vaikka se ei olekin yleisimmin käytetty menetelmä tähän tarkoitukseen.

Mutta resurssien niukkuuden tapauksessa sitä voidaan käyttää, sillä sillä on samanlainen toiminnallisuus kuin Papanicolaou-tekniikan tarjoamalla ja edullisemmalla hinnalla. Se vaatii kuitenkin tutkijan asiantuntemuksen.

sytogenetiikka

Asiaankuuluva piirre Giemsa-värjäyksessä on sen kyky sitoutua voimakkaasti adeniini- ja tymiinirikkaisiin DNA-alueisiin. Tämän avulla DNA voidaan visualisoida solumitoosin aikana eri kondensaatiotiloissa.

Nämä tutkimukset ovat välttämättömiä kromaattisten poikkeamien, kuten kromosomien eri alueiden päällekkäisyyksien, deleetioiden tai translokaatioiden, havaitsemiseksi.

Giemsa-värjäyksen tehokkuutta osoittava tutkimus

Cannova et ai (2016) vertasivat 3 värjäystekniikkaa ihon leishmaniaasin diagnoosissa.

Tätä varten he käyttivät näytteitä, jotka oli saatu koe-eläimestä (Mesocrisetus auratus), joka oli kokeellisesti siirrostettu Leishmanias-bakteereihin.

Kirjoittajat osoittivat, että Giemsa-tahra oli parempi kuin Pap-mart®- ja Gaffney-tahra. Siksi he pitivät Giemsa-värjäystä ihanteellisena ihon leishmaniaasin diagnoosissa.

Kirjailijoiden saamat erinomaiset tulokset johtuvat tosiasiasta, että Giemsa-seoksen muodostavat väriaineyhdistelmät tarjoavat tarvittavat olosuhteet suotuisan kontrastin luomiseksi, mikä mahdollistaa amastigotien rakenteiden erottamisen selvästi sekä solunsisäisesti että solunulkoisesti.

Myös muut tekniikat (Pap-mart® ja Gaffney) tekivät sen, mutta heikommalla tavalla ja siksi vaikeammin havaittavissa. Siksi Giemsa-värjäystä suositellaan leishmaniaasin parasitologiseen diagnoosiin.

Samoin Ramírez et al: n (1994) tutkimuksessa arvioitiin Giemsa- ja Lendrum-värjäysten pätevyyttä sidekalvoissa Chlamydia trachomatiksen tunnistamiseksi.

Kirjoittajat päättelivät, että Giemsa- ja Ledrum-tahroilla on sama spesifisyys, mutta Giemsa havaittiin herkemmiksi.

Tämä selittää, miksi Giemsa-värjäystä käytetään tällä hetkellä yleisimmin klamydia-infektioiden diagnosointiin, etenkin jos resursseja on vähän.

Lähde: PanReac Applyhem ITW -reagenssit. Giemsa-tahra. Versio 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Espanja.

Suositukset hyvälle värjäytymiselle

Arkkien kuivumista ei pitäisi nopeuttaa. Sen on odotettava kohtuullisen ajan kuivua ulkoilmassa. Noin 2 tuntia.

Väri heti 2 tunnin kuluttua parhaan tuloksen saamiseksi.

Jotta leikkeet kiinnittyisivät ja värjäytyisivät paremmin, näyte on jaettava objektilasille siten, että ohut ja tasainen kerros jää.

Edullinen verinäyte on kapillaarinen, koska levä on tehty suoraan veripisarasta eikä siksi näyte sisällä mitään lisäaineita, mikä suosii solurakenteiden ylläpitämistä.

Kuitenkin, jos käytetään laskimoista verta, EDTA: ta tulisi käyttää antikoagulanttina eikä hepariinina, koska hepariini yleensä muodostaa soluja.

Yleisiä virheitä Giemsa-värjäyksessä

Tämän värityksen käytännössä voidaan tehdä virheitä. Niistä ilmenee rakenteiden äänen voimakkuuden äkilliset muutokset.

Erittäin sininen väritys

Se voi johtua:

• Erittäin paksut tahrat
• Värjäytymisajan ylittäminen
• Pese riittävästi.
• Reagenssien käyttö selvästi yli neutraalin (alkalisen) pH: n.

Näissä olosuhteissa seuraavien rakenteiden värit vääristyvät siten, että punasolut lohi-vaaleanpunaisen värjäyksen sijaan vaikuttavat vihreältä, eosinofiilien rakeet, jotka on värjättävä tiilipunaisiksi, muuttuvat sinertäviksi tai harmaiksi ja niin edelleen poikkeama tavanomaisissa sävyissä.

Liian vaaleanpunainen väri

Se voi johtua:

• Riittämätön värjäytymisaika.
• Pitkäaikainen tai liiallinen pesu.
• Huono kuivaus.
• Erittäin happamien reagenssien käyttö.

Tässä erityisessä tapauksessa rakenteet, jotka värjäävät normaalisti sinisinä, eivät ole lähes näkyviä, kun taas vaaleanpunaisiksi värjäävät rakenteet ovat voimakkaasti liioiteltuja sävyjä.

Esimerkki: Punasolut muuttuvat kirkkaan punaisiksi tai kirkkaan oransseiksi, ydinkromatiini näyttää vaaleanpunaiselta ja eosinofiilirakeet värjäävät syvältä kirkkaan punaiseksi.

Saostumia esiintyy levitessä

Syyt voivat olla:

• Käytä likaisia ​​tai huonosti pestyjä kalvoja.
• Älä anna tahran kuivua hyvin.
• Jätä kiinnitysratkaisu liian kauan.
• Riittämätön pesu värjäyksen lopussa.
• Käytetyn väriaineen riittämätön suodatus tai ei suodatusta.

Morfologisten esineiden esiintyminen

Morfologiset esineet voivat esiintyä leikkeissä, mikä vaikeuttaa läsnä olevien rakenteiden visualisointia ja tulkintaa. Tämä johtuu siitä, että:

• Käytetty antikoagulanttityyppi, kuten hepariini.
• Likaisten, kuluneiden tai rasvaisten kalvojen käyttö.

Tallennustila

Valmistuksen jälkeen väriainetta on pidettävä huoneenlämpötilassa (15-25 ° C), jotta väriaine ei saostu. Sitä tulisi varastoida tiiviisti suljettuun meripihkan säiliöön.

Viitteet

1. Cannova D, Brito E ja Simons M. Värjäystekniikoiden arviointi ihon leishmaniaasin diagnoosissa. Salus. 2016; 20 (2): 24 - 29.
2. PanReac Applyhem ITW -reagenssit. Giemsa-tahra. Versio 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Espanja.
3. Clark G. Värjäysmenettelyt (1981), 4. Williams & Willkins.
4. Soveltuva kliininen kemia. Giemsa-tahra in vitro -diagnostiikkaan. Jakelija: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F ja Grazioso C. Giemsa- ja Lendrum-värjäysten kelpoisuus sidekalvoissa Chlamydia trachomatiksen tunnistamiseksi. Bol of Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212 - 216.
6. Casas-Rincón G. Yleinen mykologia. 1994. Venezuelan keskusyliopiston toinen painos, Library Editions. Venezuela Caracas.
7. "Giemsa-tahra." Wikipedia, ilmainen tietosanakirja. 1. syyskuuta 2017, kello 01:02 UTC. 6. joulukuuta 2018, es.wikipedia.org.