ZIEHL-NEELSEN-TAHRA: PERUSTEET, REAGENSSIT JA TEKNIIKKA - BIOLOGIA - 2026

Ziehl-Neelsen väriainetta tekniikka tunnistaa mikro-organismien resistenttien alkoholi happo (ARA). Tämän mikrobiologisen menetelmän nimi viittaa sen kirjoittajiin: bakteriologiin Franz Ziehliin ja patologiin Friedrich Neelseniin.

Tämä tekniikka on eräänlainen erotusvärjäys, johon sisältyy eri väriaineiden käyttö kontrastin luomiseksi rakenteiden välillä, jotka haluat tarkkailla, erottaa ja myöhemmin tunnistaa. Ziehl-Neelsen-tahraa käytetään tietyn tyyppisten mikro-organismien tunnistamiseen.

Ziehl-Neelsen-tahra

Jotkut näistä organismeista ovat mycobacteria (esim. Mycobacterium tuberculosis), nocardia (esim. Nocardia sp.) Ja jotkut yksisoluiset loiset (esim. Cryptosporidium parvum). Monet bakteerit voidaan luokitella yleisen tekniikan avulla, jota kutsutaan gram-tahraksi.

Jotkin bakteeriryhmät vaativat kuitenkin muita menetelmiä niiden tunnistamiseksi. Tekniikat, kuten Ziehl-Neelsen-värjäys, vaativat väriaineyhdistelmiä kuumuuden kanssa viimeisen kiinnittämiseksi soluseinämään.

Sitten tulee valkaisuprosessi, joka antaa kaksi tulosta: resistenssi tai herkkyys happojen ja alkoholien värjäytymiselle.

Perusta

Tämän värjäystekniikan perusteet perustuvat näiden mikro-organismien soluseinämän ominaisuuksiin. Seinä koostuu erityyppisistä rasvahapoista, joita kutsutaan mykolihapoiksi; Niille on ominaista erittäin pitkät ketjut.

Kun rasvahapoilla on erittäin pitkät rakenteet, ne pystyvät pitämään väriaineet helpommin. Joitakin bakteerisukuja on erittäin vaikea värjätä gram-värjäyksellä johtuen mykoliinihappojen suuresta pitoisuudesta soluseinämässä.

Ziehl-Neelsen-värjäyksessä käytetään fenoliyhdisteen karbolifuksiinia, emäksistä tahraa. Tällä on kyky olla vuorovaikutuksessa soluseinämän rasvahappojen kanssa, joiden rakenne on vahamainen huoneenlämpötilassa.

Karbolifuksiinin värjäytyminen paranee lämmön läsnä ollessa, koska vaha sulaa ja värimolekyylit siirtyvät nopeammin soluseinämään.

Myöhemmin käytetty happo palvelee värjäämään soluja, joita ei ole värjätty, koska niiden seinä ei ollut riittävästi sukua väriaineelle; siksi happovalkaisimen vahvuus kykenee poistamaan happovärin. Soluja, jotka kestävät tätä värinmuutosta, kutsutaan hapankestäviksi.

Toissijainen väriaine

Näytteen värin poistamisen jälkeen se kontrastoidaan toisella väriaineella, jota kutsutaan toissijaiseksi väriaineeksi. Yleensä käytetään metyleenisinistä tai malakkiittivihreää.

Toissijainen väri värjää taustamateriaalin ja luo näin ollen kontrastin rakenteille, jotka värjättiin ensimmäisessä vaiheessa. Vain värjäytyneet solut absorboivat toisen väriaineen (maalattu) ja saavat värinsä, kun taas happamat nopeasti solut säilyttävät punaisen värinsä.

Tätä menettelytapaa käytetään usein tunnistamaan mycobacterium tuberculosis ja Mycobacterium leprae, joita kutsutaan haponkestäviksi bakteereiksi.

reagenssit

Ensisijainen väriaine

Käytetään 0,3% karboolifuksiinia (suodatettu). Tämä väriaine valmistetaan alkoholiseoksesta: fenolista etanolissa (90%) tai metanolissa (95%) ja tähän seokseen liuotetaan 3 grammaa emäksistä fuksiinia.

Valkaisuliuos

Tässä vaiheessa voidaan käyttää 3-prosenttisen alkoholihapon tai 25-prosenttisen rikkihapon liuoksia.

Toissijainen väriaine (vastaväriaine)

Näytteiden kontrastiimiseksi eniten käytetty väriaine on yleensä 0,3% metyleenisinistä. Voidaan kuitenkin käyttää myös muita, kuten 0,5% malakkiittivihreä.

Tekniikka

Haponkestävä värjäysmenettely

Valmista bakteerivaaka

Tämä valmistelu tehdään puhtaalla, kuivalla objektilasilla noudattaen steriiliyttä koskevia varotoimenpiteitä.

Hajun kuivaus

Anna kerroksen kuivua huoneenlämpötilassa.

Kuumenna näyte

Näytettä tulisi lämmittää levittämällä tulta alla olevaan objektilasiin. Alkoholikiinnitys voidaan tehdä, kun leviä ei ole valmistettu ysköllä (käsitelty natriumhypokloriitilla sen valkaisemiseksi) ja jos se ei tule värjäämään välittömästi.

M. tuberculosis poistetaan valkaisuaineella ja värjäysprosessin aikana. Käsittelemättömän yskeen lämpökiinnitys ei tappaa M. tuberculosisia, kun taas alkoholin kiinnitys on bakterisidinen.

Peitä tahra

Tahra peitetään karbolifuksiiniliuoksella (primaarinen emäksinen tahra).

Kuumenna tahra

Tätä tehdään 5 minuutin ajan. Huomaa, että höyry kehittyy (noin 60 ° C). On tärkeää, että ylikuumene ja välttää näytteen polttamista.

Tahdan lämmittämisessä on noudatettava erityistä varovaisuutta karbolifuksiinin kuumentamisessa, varsinkin jos värjäys tehdään alustalle tai muulle astialle, johon on kerätty edellisen värjäyksen helposti syttyviä kemikaaleja.

Levyjen alle tulisi antaa vain pieni liekki käyttämällä aiemmin valaistua tamponia, joka on kostutettu muutamalla tipalla happamaa alkoholia, metanolia tai 70% etanolia. Vältä käyttämästä suurta etanoliin kastettua tampoon, koska se on palovaara.

Pese tahra

Tämä pesu on tehtävä puhtaalla vedellä. Jos vesijohtovesi ei ole puhdasta, pese miedos suodatetulla tai tislatulla vedellä, mieluiten.

Peitä muste hapolla alkoholilla

Tämän hapan alkoholin tulisi olla 3%. Peitto suoritetaan 5 minuutin ajan tai kunnes levä on värjäytynyt riittävästi, ts. Väriltään vaaleanpunainen.

On otettava huomioon, että hapan alkoholi on syttyvää; siksi sitä on käytettävä erittäin huolellisesti. Vältä lähellä syttymislähteitä.

Pese tahra

Pesun tulee tapahtua puhtaalla, tislatulla vedellä.

Peitä tahra tahralla

Se voi olla malakkiittivihreä (0,5%) tai metyleenisininen (0,3%) tahra 1 - 2 minuutin ajan, pidempi käyttöaika, jos pinta on ohut.

Pese tahra

Jälleen puhdasta (tislattua) vettä tulisi käyttää.

Valua

Dian takaosa on puhdistettava ja tahra asetettava tyhjennystelineelle, jotta se voi kuivua (älä käytä imukykyistä paperia kuivaamiseen).

Tutki muste mikroskoopin alla

100X objektiivi ja upotusöljy on käytettävä. Skannaa levitys järjestelmällisesti ja kirjaa asianmukaiset havainnot.

Tulkitse tulokset

Teoreettisesti punertavan värisiä värjäviä mikro-organismeja pidetään haponkestävänä positiivisina (AAR +).

Päinvastoin, jos mikro-organismit värjäävät sinisinä tai vihreinä, vastavärinä käytetystä väriaineesta riippuen, niitä pidetään haponkestävänä negatiivisena (AAR-).

Viitteet

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Käytännön mikrobiologian perusteet (1. painos). Jaypee Brothers Medical Publishers.
2. Bauman, R. (2014). Mikrobiologia sairauksien avulla kehojärjestelmällä (4. painos). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Johdanto-mikrobiologia (1. painos). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Mikrobiologian laboratorio-opas ja työkirja: Sovellukset potilaan hoitoon (11. painos). McGraw-Hill koulutus.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Oppikirja mikrobiologiasta (1. painos). BI-julkaisut PVT.