UREALIEME: PERUSTA, VALMISTELU JA KÄYTTÖ - BIOLOGIA - 2026

Urea liemi on nestemäistä kasvualustaa, jota käytetään havaitsemaan ureaasientsyymin tietyissä mikro-organismeja. Ureaasi on mikrobinen entsyymi, joka tuotetaan konstitutiivisella tavalla, ts. Se syntetisoidaan riippumatta siitä, onko substraatti, jolla se toimii.

Ureaasin toiminta liittyy orgaanisten yhdisteiden hajoamiseen. Kaikki mikro-organismit eivät kykene syntetisoimaan tätä entsyymiä, joten sen määritys laboratoriossa mahdollistaa tiettyjen bakteerikantojen tunnistamisen ja jopa erottamisen saman suvun lajien välillä.

Negatiivinen ja positiivinen ureatesti. Lähde: Kuva kirjoittanut MSc. Marielsa Gil.

Ureatestejä on kahta tyyppiä: Stuart ja Christensen. Ne eroavat koostumuksestaan ​​ja herkkyydestään. Ensimmäinen on erityinen osoittaen suurta määrää ureaasia, jota tuottavat Proteus-suvun lajit.

Toinen on herkempi ja pystyy havaitsemaan pienet määrät ureaasia, jonka myöhemmin tuottavat muut bakteerisukut, kuten Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter ja Mycobacterium.

Stuartin urealieme koostuu ureasta, natriumkloridista, kaliumfosfaatista, monokaliumfosfaatista, hiivauutteesta, fenolipunasta ja tislatusta vedestä.

Samaan aikaan Christensenin urealieme tai agar koostuu peptoneista, natriumkloridista, monokaliumfosfaatista, glukoosista, ureasta, fenolipunasta, tislatusta vedestä ja agar-agarista. Jälkimmäinen vain, jos se on kiinteä väliaine.

Perusta

Ureaasi-entsyymi hydrolysoi ureaa hiilidioksidin, veden ja kahden ammoniakkimolekyylin muodostamiseksi. Nämä yhdisteet reagoivat muodostaen lopputuotteen, nimeltään ammoniumkarbonaatti.

Stuartin urealieme

Stuartin urealieme puskuroidaan enemmän pH: n ollessa 6,8. Siksi mikro-organismin on kyettävä muodostamaan suuria määriä ammoniakkia fenolipunaiseksi muuttumiseksi. PH: n tulisi nousta yli 8: n.

Siksi Stuartin urealieme on selektiivinen Proteus-lajeille, antaen positiivisia tuloksia 24 - 48 tunnin sisällä inkubaatiosta, eikä se ole tehokas bakteereille, jotka tuottavat vähäisiä määriä ureaasia tai hydrolysoivat hitaasti ureaa.

Tämä johtuu siitä, että Proteus-lajit pystyvät käyttämään ureaa typen lähteenä. Sen sijaan muut ureaasia tuottavat bakteerit tarvitsevat lisälähteen.

Kuitenkin Pérez et ai. (2002) määrittivät, että Stuartin urealieme oli yhtä tehokas kuin Christensenin urea-agar määritettäessä ureaasia Candida-, Cryptococcus-, Rhodotorula-, Trichosporon- ja Saccharomyces-sukujen hiivakannoissa.

Tutkimuksen kirjoittajat väittävät saavuttaneensa 100-prosenttisen sopimuksen molempien media-aineiden (Stuart ja Christensen) kanssa inkuboidessaan 24 ja 48 tuntia; lukuun ottamatta kantoja, jotka onnistuivat muuttamaan väliaineen vahvaksi vaaleanpunaiseksi-fuksiseksi väreksi, pidettiin positiivisina.

Tämä selvennys on välttämätön, koska Lodder (1970) totesi, että melkein kaikilla hiivoilla on mahdollista muuttaa Christensen-urea-agar viiste vaaleanpunaiseksi. Tämä johtuu tosiasiasta, että ne voivat hydrolysoida ureaa minimaalisin määrin, ja amiinien muodostumisen aminohappojen oksidatiivisella dekarboksyloinnilla pinnalla. Tätä ei pidä tulkita positiiviseksi.

Christensenin urea-agari tai lieme

Christensenin urealieme tai agar ei ole puskuroitu vähemmän, koska se pystyy havaitsemaan pienet määrät ammoniakkia. Lisäksi tämä väliaine on rikastettu peptoneilla ja glukoosilla. Nämä yhdisteet saavat aikaan uusia ureaasia tuottavia mikro-organismeja, jotka eivät kasva Stuart-liemessä.

Samoin Christensen-ureatesti tarjoaa nopeampia tuloksia, etenkin Proteukselle, sillä se pystyy antamaan voimakkaasti positiivisen tuloksen vain 30 minuutissa vähintään ja enintään 6 tuntiin enimmäisajana.

Loput ureaasia tuottavista mikro-organismeista onnistuvat kääntämään väliaineen värin hiukan 6 tunnin kuluttua ja voimakkaasti 24, 48, 72 tunnin tai enemmän jälkeen, ja jopa jotkut kannat voivat antaa heikkoja reaktioita 5 tai 6 päivän kuluttua.

Molempien medioiden tulkinta (Stuart ja Christensen)

Elatusaine on alun perin väriltään kellanoranssi, ja positiivinen reaktio muuttaa väliaineen värin vaaleanpunaiseksi-fuksiseksi. Värin voimakkuus on suoraan verrannollinen tuotetun ammoniakin määrään.

Negatiivinen reaktio jättää väliaineen alkuperäisväriksi lukuun ottamatta hiivoja, jotka voivat muuttua vaaleanpunaiseksi Christensenin urea-agarialustassa.

Valmistautuminen

Stuartin urealieme

Punnitaan tarvittavat grammat kaupallisen yrityksen ohjeiden mukaan. Liuota edullisesti steriiliin tislattuun veteen. Älä käytä lämpöä liukenemiseen, koska urea on herkkä lämmölle.

Kalvosuodatusta käytetään sterilointiin. Tätä varten käytetään Millipore-suodatinta, jonka huokosten halkaisija on 0,45 u. Älä käytä autoklaavia. Kun liuos on suodatettu, se jaetaan steriileihin putkiin. Luotettavien tulosten saamiseksi se tulisi siirtää vähintään 1,5 ml: n ja enintään 3 ml: n välillä putkea kohti.

Säilytä jääkaapissa ja lämpimänä ennen käyttöä.

Jos suodatusmenetelmää ei ole saatavilla, väliainetta on käytettävä heti luotettavien tulosten saamiseksi.

Toinen tapa valmistaa Stuartin urealieme on seuraava:

Jotkut kaupalliset talot myyvät ureakokeen perustana olevaa väliainetta, ilman ureaa.

Kaupallisen yrityksen ilmoittama määrä punnitaan. Se liuotetaan tislattuun veteen ja steriloidaan autoklaavissa 121 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Annetaan seistä vähän ja kun väliaine on lämmin, lisää 100 ml urealiuosta, joka on valmistettu 20%: lla ja steriloitu suodattamalla.

Se jaetaan steriileihin putkiin, kuten aiemmin on kuvattu.

Christensenin urea-agari tai lieme

-Urealiuoksen valmistus

Punnitaan 29 g dehydratoitua ureaa ja liuotetaan 100 ml: aan tislattua vettä. Käytä suodatusmenetelmää sterilointiin. Älä autoklaavoi.

- ureapohjainen agar

Liuota 24 g dehydratoitua emäksistä agaria 950 ml: aan tislattua vettä. Steriloidaan autoklaavissa 121 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Anna sen levätä, kunnes se saavuttaa lämpötilan 50 ° C, ja lisää aiemmin valmistettu urea aseptisesti.

Kaada 4-5 ml steriileihin putkiin ja kallista kunnes kiinteä. Pitäisi olla pitkä huilu nokka.

Tämä väliaine voidaan myös valmistaa nestemäisessä muodossa.

Sovellukset

Ureatesti on erittäin tehokas erottamaan Proteus-suvun muista suvusta Enterobacteriaceae-perheen perheessä, kun otetaan huomioon Proteuksen tarjoama nopea reaktio.

Christensen-koostumusta käyttämällä testi auttaa erottamaan saman suvun lajit. Esimerkiksi S. haemolyticus ja S. warneri ovat koagulaasnegatiivisia ja beeta-hemolyyttisiä Staphylococcus -bakteereja, mutta eroavat toisistaan ​​siinä, että S. haemolyticus on ureanegatiivinen ja S. warneri on ureapositiivinen.

Toisaalta McNulty käytti Christensenin 2-prosenttista urealiemettä tutkimaan Helicobacter pylori -bakteerin esiintymistä mahan limakalvosta (antraalialue) otetuissa biopsianäytteissä.

H. pylorin esiintyminen on osoitettu positiivisella ureakokeella. Tulosten tarkkailun kestoaika on suoraan verrannollinen läsnä olevien mikro-organismien määrään.

Kuten voidaan nähdä, se on yksinkertainen menetelmä Helicobacter pylorin diagnosoimiseksi mahalaukun biopsioissa.

Viimeiseksi, tämä testi on hyödyllinen myös lajien erottamisessa suvusta Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus ja Mycobacteria.

Ureakokeen kylvö

Molemmat menetelmät vaativat vahvan mikrobi-siirroksen tulosten optimoimiseksi. Bakteerikolonnit otetaan edullisesti veriagarista ja hiivat Sabouraud-agarista, muutamaa poikkeusta lukuun ottamatta. Inokulaatti emulgoidaan nestemäiseen väliaineeseen.

Inkuboi Stuartin urealiemessä 37 ºC: ssa 24 - 48 tuntia, tietäen, että etsit Proteus-kantoja vain, kun kanta on bakteeri. Hiivoissa sitä voidaan inkuboida 37 ° C: ssa tai huoneenlämpötilassa 24 - 48 tunnin inkuboinnin ajan.

Christensenin urealiemen tapauksessa inkuboidaan 37 ºC: ssa 24 tuntia. Jos testi on negatiivinen, sitä voidaan inkuboida enintään 6 vuorokautta. Jos testi on positiivinen ennen kuutta tuntia, se osoittaa, että se on Proteus-suvun kanta.

Christensenin urea-agarin tapauksessa agar-viiste siirretään voimakkaasti ilman puhkaisua. Liemi inkuboidaan ja tulkitaan samalla tavalla.

QA

Kontrollikantoja, kuten Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 ja Salmonella typhimurium, voidaan käyttää kasvualustan testaamiseen. Kahden ensimmäisen tulisi antaa positiivisia tuloksia ja kahden viimeisen negatiivisen tuloksen.

Lähde: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5. toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.

Viitteet

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et ai. Stuartin urealiemen käyttö ureaasikokeessa testina hiiva-diagnoosissa. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136 - 140. Saatavana osoitteessa: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Biokemialliset testit kliinisesti tärkeiden bakteerien tunnistamiseksi. 3. toim. Toimituksellinen Panamericana. Buenos Aires. Argentiina.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott: n mikrobiologinen diagnoosi. 12 toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5. toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
5. Britannia Laboratories. Christensen Medium (urea-agaripohja) 2015. Saatavissa osoitteessa: britanialab.com