SYTOKEMIA: HISTORIA, TUTKIMUSKOHDE, HYÖDYLLISYYS JA TEKNIIKAT - BIOLOGIA - 2026

Sytokemian käsittää sarjan tekniikoita, jotka ovat riippuvaisia tunnistamisesta ja sijoitus tiettyjen aineiden solun sisällä. Sitä pidetään solubiologian haarana, joka yhdistää solumorfologian kemialliseen rakenteeseen.

Nykyaikaisen sytologian sovelluksen perustajan Bensleyn mukaan sytokemian tarkoituksena on löytää solujen kemiallinen organisaatio elämän salaisuuksien ymmärtämiseksi. Sen lisäksi, että tutkitaan eri toiminnallisissa vaiheissa tapahtuvia dynaamisia muutoksia.

1: Pagetin extramammary tauti. (Hematoksyliini-eosiini) 2: seniilit plakit, joita havaitaan aivokuoressa Alzheimerin tautia sairastavan potilaan kohdalla. (Hopea kyllästäminen) 3: Kani kieli, kollageenikuitut (sininen). Lihaskuidut (violetit nauhat). (Massonin trikromi). 4: Maksakudos, jossa on rasvan rappeutumista. (Sudan III) 5: tulehtunut maksa. Kuolion. (Toluidiininsiniset) Lähteet: Wikipedia. fi / Käyttäjä: KGH / Julkisen verkkotunnuksen tiedostot / Mohit Lalwani

Tällä tavalla on mahdollista määrittää näiden aineiden metabolinen rooli solussa.

Sytokemiassa käytetään kahta päämenetelmää. Ensimmäinen perustuu kemiallisiin ja fysikaalisiin menettelyihin. Nämä tekniikat turvautuvat mikroskoopin käyttöön välttämättömänä välineenä kemiallisten reaktioiden visualisoimiseksi, jotka tapahtuvat solun erityisissä aineissa.

Esimerkki: sytokemiallisten väriaineiden, kuten esimerkiksi Feulgen-reaktion tai PAS-reaktion, käyttö.

Toinen menetelmä perustuu biokemiaan ja mikrokemiaan. Tällä menetelmällä on mahdollista kvantitatiivisesti määrittää solunsisäisten kemikaalien läsnäolo.

Aineisiin, jotka voidaan paljastaa kudos- tai solurakenteessa, ovat seuraavat: proteiinit, nukleiinihapot, polysakkaridit ja lipidit.

Sytokemian historia

Sytokemialliset tekniikat niiden keksintöjen jälkeen ovat auttaneet ymmärtämään solujen koostumusta, ja ajan myötä on syntynyt erilaisia ​​tekniikoita, joissa käytetään erityyppisiä väriaineita, joilla on erilaiset affiniteetit ja perusteet.

Myöhemmin sytokemia avasi uusia näköaloja käyttämällä tiettyjä substraatteja osoittamaan kolorimetrisesti entsyymien tai muiden molekyylien läsnäolo solussa.

Samoin on syntynyt muita tekniikoita, kuten immunosytokemia, joka on ollut suureksi avuksi monien sairauksien diagnosoinnissa. Immunosytokemia perustuu antigeeni-vasta-ainereaktioihin.

Toisaalta sytokemia on käyttänyt myös fluoresoivia aineita, nimeltään fluorokromeja, jotka ovat erinomaisia ​​markkereita tiettyjen solurakenteiden havaitsemiseksi. Fluorikromin ominaisuuksien vuoksi se korostaa rakenteita, joihin se on kiinnitetty.

Mitä sinä opiskelet?

Biologisessa näytteessä käytetyillä erilaisilla sytokemiallisilla tekniikoilla on jotain yhteistä: ne paljastavat tietyn tyyppisen aineen läsnäolon ja tietävät sen sijainnin arvioitavassa biologisessa rakenteessa, olipa kyse sitten solutyypistä tai kudoksesta.

Nämä aineet voivat olla entsyymejä, raskasmetalleja, lipidejä, glykogeenia ja määriteltyjä kemiallisia ryhmiä (aldehydit, tyrosiini jne.).

Näiden tekniikoiden tarjoamat tiedot voivat antaa ohjeita paitsi solujen tunnistamiseksi myös erilaisten patologioiden diagnosoimiseksi.

Esimerkiksi sytokemialliset tahrat ovat erittäin hyödyllisiä erotettaessa erityyppiset leukemiat, koska jotkut solut ilmentävät tiettyjä entsyymejä tai avainaineita ja toiset eivät.

Toisaalta on huomattava, että sytokemian käytön mahdollistamiseksi on otettava huomioon seuraavat seikat:

1) Aine on kiinnitettävä paikalleen, josta se luonnollisesti löytyy.

2) Aine on tunnistettava substraateilla, jotka reagoivat spesifisesti sen kanssa, ei muiden yhdisteiden kanssa.

Apuohjelma

Näytteet, joita voidaan tutkia sytokemiallisilla tekniikoilla, ovat:

- Laajennettu perifeerinen veri.

- Laajennettu luuydin.

- Histokemiallisiin tekniikoihin kiinnitetyt kudokset.

- Solut, jotka on kiinnitetty sytoestrifugoinnilla.

Sytokemialliset tekniikat tukevat voimakkaasti hematologiaa, koska niitä käytetään laajalti avuksi tietyntyyppisten leukemioiden diagnoosissa ja eriyttämisessä.

Esimerkiksi: Esteraasireaktioita käytetään erottamaan myelomonosyyttinen leukemia akuutista monosyyttisestä leukemiasta.

Näiden potilaiden luuytimen ja ääreisveren tahrat ovat samanlaisia, koska joitain soluja on vaikea tunnistaa yksin morfologisesti. Tätä varten suoritetaan esteraasikoe.

Ensimmäisessä spesifiset esteraasit ovat positiivisia, kun taas toisessa epäspesifiset esteraasit ovat positiivisia.

Ne ovat myös erittäin hyödyllisiä histologiassa, koska esimerkiksi raskasmetallien värjäystekniikan käyttö (hopean kyllästäminen) värjää voimakkaan ruskean värin retikulaariset kuidut sydänkudoksessa.

Sytokemian tekniikat

Käytetyimmät tekniikat selitetään alla:

- Väriaineiden käyttö

Käytetyt tahrat ovat hyvin erilaisia ​​sytokemiallisissa tekniikoissa, ja ne voidaan luokitella useiden näkökulmien perusteella:

Sen radikaalin mukaan, johon heillä on affiniteetti

Ne jaetaan: happamiin, emäksisiin tai neutraaleihin. Ne ovat historian yksinkertaisimpia ja eniten käytettyjä, mikä antaa meille mahdollisuuden erottaa basofiiliset komponentit hapofiilisistä. Esimerkki: hematoksyliini-eosiinivärjäys.

Tässä tapauksessa solujen ytimet värjäytyvät sinisiksi (ne ottavat hematoksyliiniä, joka on emäksinen tahra) ja sytoplasmat, punaiset (ne ottavat eosiinia, joka on happo tahra).

Niiden värin mukaan

Ne voivat olla ortokromaattisia tai metakromaattisia. Ortokromaattiset aineet värjäävät samanväriset rakenteet kuin väriaineella. Esimerkiksi eosiinikotelo, jonka väri on punainen ja värjää punaisena.

Toisaalta metakromaatit värjäävät rakenteeltaan erilaisen värin kuin heidän, kuten esimerkiksi toluidiini, jonka väri on sininen ja värjää kuitenkin violetti.

Elinvoimaiset tai supravitaliset väriaineet

Ne ovat vaarattomia väriaineita, ts. Ne värjäävät solut ja pysyvät hengissä. Näitä tahroja kutsutaan elintärkeiksi (esim. Trypaanisiniset makrofagien värjäämiseen) tai supravitalisiksi (esim. Janus vihreä värjäämään mitokondrioiksi tai neutraaliksi punaisiksi värjättäessä lysosomeja).

- Lipidien havaitseminen rasvaliukoisilla väriaineilla

Osmiumtetroksidi

Se värjää lipidit (tyydyttymättömät rasvahapot) mustana. Tämä reaktio voidaan havaita valomikroskoopilla, mutta koska tämä väriaine on erittäin tiheää, se voidaan myös visualisoida elektronimikroskoopilla.

Sudan III

Se on yksi eniten käytettyjä. Tämä väriaine diffundoituu ja liukenee kudoksiin kerääntyen lipidipisaroiden sisään. Väri on punainen.

Sudanin musta tahra B

Se tuottaa paremman kontrastin kuin aikaisemmat, koska kykenee liukenemaan myös fosfolipideihin ja kolesteroliin. Se on käyttökelpoinen kypsien granulosyyttien atsurofiilisten ja spesifisten rakeiden ja niiden esiasteiden havaitsemiseksi. Siksi se tunnistaa myeloidiset leukemiat.

- Aldehydiryhmävärjäys (jaksollinen happo Schiff-värjäys)

Jaksollinen happo Schiff-värjäys voi havaita kolmen tyyppisiä aldehydiryhmiä. He ovat:

- Vapaat aldehydit, joita on luonnollisesti kudoksissa (plasmareaktio).

- Aldehydit, jotka tuotetaan selektiivisellä hapetuksella (PAS-reaktio).

- Aldehydit, jotka muodostuvat selektiivisellä hydrolyysillä (Feulgen-reaktio).

PAS-reaktio

Tämä värjäys perustuu tietyntyyppisten hiilihydraattien, kuten glykogeenin, havaitsemiseen. Jaksollinen happo Schiff rikkoo hiilihydraattien CC-sidokset glykoliryhmien 1-2 hapettumisen johdosta, mikä onnistuu vapauttamaan aldehydiryhmiä.

Vapaat aldehydiryhmät reagoivat Schiffin reagenssin kanssa ja muodostavat violetti-punaisen yhdisteen. Violetti-punaisen värin ulkonäkö osoittaa positiivisen reaktion.

Tämä testi on positiivinen kasvisoluissa, ja se havaitsee tärkkelystä, selluloosaa, hemiselluloosaa ja peptiinejä. Eläinsoluissa se havaitsee muciineja, mukoproteiineja, hyaluronihappoa ja kitiinia.

Lisäksi se on käyttökelpoinen lymfoblastisten leukemioiden tai erytroleukemian diagnoosissa muiden myelodysplastisen tyyppisten patologioiden joukossa.

Happamien hiilihydraattien tapauksessa voidaan käyttää alcinisinistä tahraa. Testi on positiivinen, jos havaitaan vaaleansininen / turkoosi väri.

Plasmainen reaktio

Plasmareaktio paljastaa tiettyjen pitkäketjuisten alifaattisten aldehydien, kuten kämmenen ja stearalin, läsnäolon. Tätä tekniikkaa sovelletaan pakastettuihin histologisiin osiin. Se käsitellään suoraan Schiffin reagenssilla.

Hiiren reaktio

Tämä tekniikka havaitsee DNA: n läsnäolon. Tekniikka koostuu kiinteän kudoksen altistamisesta heikolle happohydrolyysille myöhemmin sen saattamiseksi reagoimaan Schiffin reagenssin kanssa.

Hydrolyysi paljastaa deoksiribosialdehydiryhmät deoksiriboosi-puriinisidoksessa. Sitten Schiffin reagenssi reagoi vapaina jätettyjen aldehydiryhmien kanssa.

Tämä reaktio on positiivinen ytimissä ja negatiivinen solujen sytoplasmissa. Positiivisuudesta osoittaa punainen väri.

Jos tämä tekniikka yhdistetään metyylivihreän pyroniinin kanssa, on mahdollista havaita samanaikaisesti DNA ja RNA.

- Sytokemialliset tahrat proteiinirakenteille

Tätä varten voidaan käyttää Millon-reaktiota, jossa reagenssina käytetään elohopeanitraattia. Aromaattisia aminohappoja sisältävät rakenteet värjäävät punaisina.

- Sytokemialliset tahrat, jotka käyttävät substraatteja entsyymien osoittamiseen

Nämä tahrat perustuvat biologisen näytteen inkubointiin tietyn substraatin kanssa, ja reaktiotuote reagoi myöhemmin diatsosuolien kanssa värillisen kompleksin muodostamiseksi.

esteraasit

Nämä entsyymit ovat läsnä joidenkin verisolujen lysosomeissa ja kykenevät hydrolysoimaan naftoolia vapauttavia orgaanisia estereitä. Jälkimmäinen muodostaa liukenemattoman atsovärin, kun se sitoutuu diatsosuolaan, värjäämällä paikan, jossa reaktio tapahtuu.

Substraatteja on useita, ja riippuen siitä mitä käytetään, spesifiset esteraasit ja epäspesifiset esteraasit voidaan tunnistaa. Ensimmäisiä esiintyy myeloidisarjan epäkypsissä soluissa ja jälkimmäisiä monosyyttisen alkuperän soluissa.

Spesifisten esteraasien määrittämiseen käytetty substraatti on: naftooli-AS-D-klooriasetaatti. Vaikka epäspesifisten esteraasien määrittämiseen voidaan käyttää useita substraatteja, kuten naftooli-AS-D-asetaatti, alfa-naftyyliasetaatti ja alfa-naftyylibutyraatti.

Molemmissa tapauksissa solut värjäävät syvän punaisina, kun reaktio on positiivinen.

myeloperoksidaasi

Tätä entsyymiä esiintyy granulosyyttisten solujen ja monosyyttien atsurofiilisissä rakeissa.

Sen havaitsemista käytetään erottamaan myeloidipohjaiset leukemiat lymfoidista. Myeloperoksidaaseja sisältävät solut muuttuvat okkeriksi keltaisiksi.

fosfataasit

Nämä entsyymit vapauttavat fosforihappoja eri substraateista. Ne eroavat toisistaan ​​substraatin spesifisyyden, pH: n ja estäjien ja inaktivaattoreiden vaikutuksen perusteella.

Tunnetuimpia ovat fosfomonoesteraasit, jotka hydrolysoivat yksinkertaisia ​​estereitä (PO). Esimerkki: alkalinen fosfataasi ja hapan fosfataasi, samoin kuin fosfamidaasit, jotka hydrolysoivat sidoksia (PN). Niitä käytetään erottamaan lymfoproliferatiiviset oireyhtymät ja karvasoluleukemian diagnosointiin.

- Trikromiset värit

Mallary-Azan-trikromi

Ne ovat käyttökelpoisia solujen sytoplasman erottamiseksi sidekudoksen kuiduista. Solut värjäävät punaisina ja kollageenikuidut sinisinä.

Massonin trikromi

Tällä on sama hyöty kuin edellisellä, mutta tässä tapauksessa solut värjäävät punaisina ja kollageenikuitut vihreinä.

- Väriaineet, jotka värjäävät tiettyjä organelleja

Janus Green

Se värjää valikoivasti mitokondrioita.

Hopeasuolat ja osmihappo

Värjää Golgi-laitteen.

Toluidiinin sininen

Värjää Nissin ruumiit

Hopeasuolat ja PAS

Ne värjäävät verkkokudokset ja pohjakerroksen.

Orceiini- ja fukssiiniresorsiini

Ne värjäävät elastisia kuituja. Ensimmäisen kanssa ne on värjätty ruskeaksi ja toisen syvän siniseksi tai violetiksi.

- Muut sytokemiassa käytetyt tekniikat

Fluoresoivien aineiden tai fluorikromien käyttö

On tekniikoita, joissa fluoresoivia aineita tutkitaan rakenteen sijainnista solussa. Nämä reaktiot visualisoidaan erityisellä mikroskoopilla, jota kutsutaan fluoresenssiksi. Esimerkki: IFI-tekniikka (epäsuora immunofluoresenssi).

Solukomponenttien havaitseminen immunosytokemialla

Nämä tekniikat ovat erittäin hyödyllisiä lääketieteessä, koska ne auttavat havaitsemaan tietyn solurakenteen ja myös sen kvantifioimaan. Tämä reaktio perustuu antigeeni-vasta-ainereaktioon. Esimerkiksi: ELISA-tekniikat (Enzyme Immuno Assay).

suosituksia

- Väriaineiden hyvän suorituskyvyn arvioimiseksi on välttämätöntä käyttää kontrollieviä.

- Sytokemiallisessa värjäyksessä tulisi käyttää tuoreita määriä. Jos se ei ole mahdollista, ne tulee pitää suojassa valolta ja säilyttää 4 ° C: ssa.

- On varmistettava, että käytetty kiinnitin ei vaikuta negatiivisesti tutkittavaan aineeseen. Toisin sanoen sitä on estettävä voimasta uutta tai estää sitä.

- Kiinnitysaineiden käyttöaikaa on noudatettava, koska yleensä sen tulisi kestää vain sekuntia, koska pistäminen pidempään kiinnittimelle voi vahingoittaa joitakin entsyymejä.

Viitteet

1. "Cytochemistry." Wikipedia, ilmainen tietosanakirja. 30. kesäkuuta 2018, kello 17:34 UTC. 9. heinäkuuta 2019, 02:53 Saatavana: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Sydänlihaskudoksen tutkimiseen liittyvät metalliset impregnointimenetelmät: vertaileva tutkimus. RFM 2002; 25 (2): 224 - 230. Saatavana osoitteessa: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Happofosfataasin sytokemia: metodologiset näkökohdat. Diagn. Biol., 200; 50 (2): 89 - 92. Saatavana osoitteessa: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Solu- ja molekyylibiologia. 11. painos. Toimituksellinen Ateneo. Buenos Aires, Argentiina.
5. Klassiset työkalut solubiologian opiskeluun. TP 1 (lisäaine) - solubiologia. Saatavana osoitteessa: dbbe.fcen.uba.ar