DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-FENYYLIINDOLI): OMINAISUUDET, PERUSTEET, KÄYTTÖ - KEMIA - 2025

DAPI (4', 6-diamino-2-fenyyli) on väriaineen fluoresenssiominaisuus toimii merkki, jota käytetään laajasti alalla fluoresenssimikroskopian tai virtaussytometrialla, mm. Sen lähettämä fluoresenssi on kirkkaan sinistä, sen viritys tapahtuu välillä 455-461 nm (UV-valo).

DAPI-väriaine voi kulkea kuolleiden solujen solukalvon läpi erittäin helposti. Se voi myös tahrata elävien solujen ytimet, mutta tässä tapauksessa tämän pitoisuuden on oltava korkeampi.

Fluoresoivan väriaineen DAPI kemiallinen rakenne. Lähde: Kuva: Tiedosto: DAPI.svg on vektoritiedosto tästä tiedostosta. Sitä tulisi käyttää tämän rasterikuvan sijasta, kun se ei ole huonompi / Richard Wheeler (Zephyris) Muokattu kuva

Väriaine pääsee käyttämään solu-DNA: ta, jonka suhteen sillä on erityinen affiniteetti, sitoutuen erittäin innokkaasti typpipohjaisiin adeniiniin ja tymiiniin. Tästä syystä se on erittäin hyödyllinen joissakin molekyylibiologian tekniikoissa.

Tämä yhdiste kuuluu indolivärien ryhmään, ja sen on osoitettu olevan suurempi herkkyys DNA: lle kuin etidiumbromidi ja propidiumjodidi, etenkin agaroosigeeleissä.

Tämän fluoresoivan väriaineen käyttö on hyvin laajaa, koska se on hyödyllinen: tutkittaessa DNA: n muutoksia apoptoottisissa prosesseissa (solukuolema) ja siten solujen havaitsemiseen tässä prosessissa; DNA-jalanjäljen valokuva (DNA-valokuvien tulostaminen); tutkia bakteerikontaminaatiota; tai visualisoida ydinsegmentit.

Sitä on käytetty myös kromosomaalisten nauhojen tutkimuksessa, Mycoplasmas sp -DNA: n havaitsemisessa, DNA-proteiini-vuorovaikutuksessa, solujen värjäyksessä ja laskemisessa immunofluoresenssilla ja jopa kypsien siitepölyjyvien värjäyksessä.

ominaisuudet

DAPI on lyhenne sen kemiallisesta nimestä (4 ', 6-diamidino-2-fenyyliindoli). Sen molekyylikaava on C ₁₆ H ₁₅ N ₅ Se on molekyylipaino 350,3. Lähellä UV-valon aluetta (345 - 358 nm) tapahtuu DAPI-DNA-kompleksin suurin viritys, kun taas suurin fluoresenssiemissio esiintyy välillä 455 - 461 nm.

Tälle väriaineelle on ominaista keltainen jauhe, mutta tällä fluoroforilla merkityt rakenteet lähettävät kirkkaan sinistä valoa.

Se on veteen liukeneva yhdiste, mutta sen liukenemisen nopeuttamiseksi voidaan käyttää jonkin verran lämpöä. Se voidaan laimentaa PBS: llä, mutta ei suoraan liuottaa siihen.

Kun väriaine on valmistettu, sitä on säilytettävä pimeässä, ts. Valolta suojattuna, lämpötilassa 2–8 ° C (jääkaappi). Näissä olosuhteissa väriaine on stabiili yli 3 viikkoa tai kuukautta.

Jos se on suojattu valolta, mutta jätetty huoneenlämpötilaan, sen stabiilisuus laskee 2 tai 3 viikkoon, mutta suoralle valolle altistuminen huonontuu nopeasti. Jos haluat varastoida paljon kauemmin, se voidaan jäähdyttää -20 ° C: seen jaettuna erinä.

Perusta

Tämä värjäys perustuu ydinsisäpinnan luomiseen tärkeimmissä molekyylibiologisissa tekniikoissa, kuten: virtaussytometria, fluoresenssimikroskopia ja muun muassa metafaasin kromosomien tai vaiheiden välisten ytimien värjäys.

Tämä tekniikka perustuu siihen suureen affiniteettiin, joka väriaineella on typpipohjaisiin emäksiin (adeniini ja tymiini), jotka sisältyvät geneettiseen materiaaliin (DNA) pienessä urassa. Vaikka se on sytoplasmisen tasolla, se jättää hyvin vähän taustaa.

Kun fluoresoiva väriaine sitoutuu DNA: n adeniini- ja tymiinialueisiin, fluoresenssi kasvaa merkittävästi (20 kertaa enemmän). Sen lähettämä väri on kirkkaan sininen. Erityisesti ei ole fluoresenssiemissioita, kun se sitoutuu GC (guaniini-sytosiini) emäspariin.

On tärkeää huomata, että vaikka sillä on myös affiniteettia RNA: n suhteen, tämä ei aiheuta ongelmaa, koska tämän molekyylin suurin energiaemissio tapahtuu toisella aallonpituudella (500 nm), toisin kuin DNA, joka tekee niin 460 ° C: ssa. nm. Lisäksi RNA: han sitoutuneen fluoresenssin kasvu on vain 20%.

DAPI: tä käytetään enemmän kuolleiden (kiinteiden) solujen värjäämiseen kuin eläviä soluja, koska jälkimmäisten värjäämiseen tarvitaan paljon korkeampi väriainepitoisuus, mikä johtuu siitä, että solukalvo on paljon vähemmän läpäisevä DAPI: lle, kun se on elossa.

DAPI-väriainetta voidaan käyttää yhdessä punaisen ja vihreän fluoroforien kanssa monivärikokemuksesta.

Käyttää

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenyyliindoli) on erinomainen fluorofori, ja siksi sitä käytetään laajasti erilaisissa tekniikoissa ja eri tarkoituksiin. Seuraava selittää DAPI: n käytön päätekniikoissa.

Virtaussytometria

Tutkijat Gohde, Schumann ja Zante vuonna 1978 olivat ensimmäisiä, jotka käyttivät ja ehdottivat DAPI: ta fluoroforiksi virtaussytometriatekniikassa, ja joilla oli suuri menestys johtuen sen korkeasta DNA-herkkyydestä ja korkeasta intensiteetistä fluoresenssiemissioissa.

DAPI: n käyttö tässä tekniikassa mahdollistaa solusyklin tutkimuksen, solujen kvantifioinnin ja elävien ja kuolleiden solujen värjäyksen.

Vaikka on myös muita väriaineita, kuten etidiumbromidia, Hoechst-oksidia, akridiiniaranssia ja propidiumjodidia, DAPI on yksi yleisimmin käytetyistä, koska se on valokuvia enemmän kuin aiemmin mainitut.

Tätä tekniikkaa varten solut on kiinnitettävä, tätä varten voidaan käyttää absoluuttista etanolia tai 4% paraformaldehydiä. Näyte sentrifugoidaan ja supernatantti heitetään pois, sen jälkeen solut hydratoidaan lisäämällä 5 ml PBS-puskuria 15 minuutin ajan.

Ajan kuluessa valmista DAPI-värjäys värjäyspuskurilla (FOXP3 valmistajalta BioLegend) konsentraatiossa 3 uM.

Näyte sentrifugoidaan, supernatantti heitetään pois ja peitetään sitten 1 ml: lla DAPI-liuosta 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.

Ota näyte virtaussytometriin sopivalla laserilla.

Virtausmikrofluorometria

Toinen tekniikka, jossa DAPI: tä käytetään, on virtausmikrofluorometria yhdessä toisen fluoroforin kanssa, nimeltään mitramysiini. Molemmat ovat hyödyllisiä kloroplasti-DNA: n kvantifioimiseksi erikseen, mutta DAPI sopii parhaiten T4-bakteriofagihiukkasten mittaamiseen.

hybridisaatio

Tämä tekniikka käyttää periaatteessa DNA-koettimia, jotka on merkitty fluoresoivalla väriaineella, joka voi olla DAPI.

Näyte vaatii lämpökäsittelyä kaksijuosteisen DNA: n denaturoimiseksi ja sen muuntamiseksi kahdeksi yksijuosteiseksi juosteeksi. Sen jälkeen se hybridisoidaan DAPI-leimatulla denaturoidulla DNA-koettimella, jolla on kiinnostava sekvenssi.

Myöhemmin se pestään poistamaan se, mitä ei hybridisoitunut, DNA: n visualisointiin käytetään kontrastia. Fluoresenssimikroskooppi mahdollistaa hybridisoituneen koettimen havaitsemisen.

Tämän tekniikan tarkoituksena on havaita spesifiset sekvenssit kromosomaalisessa DNA: ssa, jotta pystytään diagnosoimaan tiettyjä sairauksia.

Nämä syto-molekyylitekniikat ovat olleet suureksi avuksi yksityiskohtien määrittämisessä karyotyyppien tutkimuksessa. Hän on esimerkiksi osoittanut adenosiinin ja tymiinin emäsparirikkaat alueet, joita kutsutaan heterokromaattisiksi alueiksi tai DAPI-vyöhykkeiksi.

Tätä tekniikkaa käytetään laajasti kromosomien ja kromatiinin tutkimiseen kasveissa ja eläimissä, samoin kuin synnytystä edeltävien ja hematologisten patologioiden diagnosointiin ihmisillä.

Tässä tekniikassa suositeltava DAPI-konsentraatio on 150 ng / ml 15 minuutin ajan.

Kootut levyt tulee säilyttää valolta suojattuna lämpötilassa 2–8 ° C.

Immunofluoresenssivärjäys

Solut kiinnitetään 4-prosenttisella paraformaldehydillä. Jos on tarkoitus käyttää muita tahroja, DAPI jätetään lopussa vastamaaliksi ja solut peitetään PBS-liuoksella 15 minuutin ajan. Ajan kuluessa valmista DAPI-liuos laimentamalla PBS: llä siten, että lopullinen konsentraatio on 300 uM.

Sitten ylimääräinen PBS poistetaan ja peitetään DAPI: llä 5 minuutin ajan. Pese useita kertoja. Objektilasia tarkastellaan fluoresenssimikroskoopin alla sopivan suodattimen alla.

Käyttöturvallisuustiedote

Tätä yhdistettä on käsiteltävä varoen, koska se on yhdiste, jolla on mutageenisia ominaisuuksia. Aktiivihiiltä käytetään tämän yhdisteen poistamiseen vesiliuoksista, jotka on tarkoitus hävittää.

Käsineitä, puku- ja suojalaseja on käytettävä tämän reagenssin aiheuttamien onnettomuuksien välttämiseksi. Jos ainetta joutuu iholle tai limakalvoille, alue on pestävä riittävällä määrällä vettä.

Älä koskaan pipetä tätä reagenssia suun kautta, käytä pipettejä.

Älä saastuta reagenssia mikrobisillä aineilla, koska se johtaa virheellisiin tuloksiin.

Älä laimenna DAPI-tahraa suositeltua enemmän, koska se heikentää merkittävästi tahran laatua.

Älä altista reagenssia suoralle valolle tai pidä lämpimänä, koska se vähentää fluoresenssia.

Viitteet

1. Brammer S, Toniazzo C ja Poersch L. Corantes osallistuvat yleisesti kasvien sytogenetiikkaan. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Saatavana: scielo.
2. Impath Laboratories. DAPI. Saatavana osoitteessa menarinidiagnostics.com/
3. Cytocell Laboratories. 2019. DAPI: n käyttöohjeet. saatavana osoitteessa cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Jokiekologian käsitteet ja tekniikat. (2009). Toimituksellinen Rubes, Espanja. Saatavana osoitteessa books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Fluoresenssin käyttö modifioidussa dissektorimenetelmässä sydänkudoksen myosyyttien lukumäärän arvioimiseksi. Arch. Rintaliivit. Cardiol. 2012; 98 (3): 252 - 258. Saatavana: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Kasviplasmien läsnäolo papaijassa (Carica papaya) Meksikossa. Chapingo-lehti. Puutarhanhoitosarja, 2011; 17 (1), 47-50. Saatavana osoitteessa: scielo.org.