ENDONUKLEAASIT: TOIMINNOT, TYYPIT JA ESIMERKIT - BIOLOGIA - 2026

Endonukleaasit ovat entsyymejä, jotka leikkaavat fosfodiesterisidosten sijaitsevat nukleotidiketju. Endonukleaasin restriktiopaikat ovat erittäin erilaisia. Jotkut näistä entsyymeistä katkaisevat DNA: n (deoksiribonukleiinihappo, geenimateriaalimme) melkein missä tahansa, ts. Ne ovat epäspesifisiä.

Sitä vastoin on toinen ryhmä endonukleaaseja, jotka ovat hyvin spesifisiä pilkottavalla alueella tai sekvenssissä. Tämä entsyymiryhmä tunnetaan restriktioentsyymeinä ja ne ovat erittäin käyttökelpoisia molekyylibiologiassa. Tässä ryhmässä meillä on tunnetut entsyymit BamHI, Eco RI ja Alu I.

Endonukleaasit leikkaavat DNA: n sisäisesti.

Lähde: pixabay.com

Vastoin endonukleaaseja, on olemassa toisen tyyppisiä katalyyttisiä proteiineja - eksonukleaaseja -, jotka vastaavat fosfodiesterisidosten katkeamisesta ketjun päässä.

Restriktioendonukleaasit

Restriktioendonukleaasit tai restriktioentsyymit ovat katalyyttisiä proteiineja, jotka vastaavat fosfodiesterisidosten katkaisemisesta DNA-ketjun sisällä hyvin spesifisissä sekvensseissä.

Nämä entsyymit voidaan ostaa useilta bioteknologiayrityksiltä, ​​ja niiden käyttö on melkein välttämätöntä nykyisissä DNA-manipulointitekniikoissa.

Restriktioendonukleaasit nimetään käyttämällä niiden organismien binomiaalisen tieteellisen nimen ensimmäisiä kirjaimia, joista he ovat peräisin, ja sitten kantaa (tämä on valinnainen) ja päättyen restriktioentsyymien ryhmään, johon ne kuuluvat. Esimerkiksi BamHI ja EcoRI ovat laajalti käytettyjä endonukleaaseja.

DNA-aluetta, jonka entsyymi tunnistaa, kutsutaan restriktiopaikaksi ja se on ainutlaatuinen jokaiselle endonukleaasille, vaikka useat entsyymit voivat osua yhteen restriktiopaikoissa. Tämä kohta koostuu yleensä lyhyestä palindromisesta sekvenssistä, joka on noin 4 - 6 emäsparia, kuten AGCT (Alu I: lle) ja GAATTC: lle Eco RI: lle.

Palindromic sekvenssit ovat sekvenssejä, jotka, vaikka lukevat suunnassa 5 '- 3' tai 3 '- 5', ovat identtisiä. Esimerkiksi EcoRI: n tapauksessa palindrominen sekvenssi on: GAATTC ja CTTAAG.

Restriktioendonukleiden toiminnot ja sovellukset

Onneksi molekyylibiologille bakteerit ovat kehittäneet evoluution aikana sarjan restriktioendonukleaaseja, jotka fragmentoivat sisäisesti geneettistä materiaalia.

Luonnossa nämä entsyymit ovat kehittyneet - oletettavasti - bakteereja suojaavana järjestelmänä vieraiden DNA-molekyylien, kuten esimerkiksi faagien, tunkeutumista vastaan.

Natiivin ja vieraan geneettisen materiaalin erottamiseksi nämä restriktioendonukleaasit voivat tunnistaa spesifiset nukleotidisekvenssit. Siten DNA, jolla ei ole tätä sekvenssiä, voidaan häiritä bakteerien sisällä.

Sitä vastoin, kun endonukleaasi tunnistaa restriktiokohdan, se sitoutuu DNA: han ja leikkaa sen.

Biologit ovat kiinnostuneita elävien esineiden geneettisen materiaalin tutkimisesta. DNA koostuu kuitenkin useista miljoonista emäsparista. Nämä molekyylit ovat erittäin pitkiä ja ne on analysoitava pieninä kappaleina.

Tämän tavoitteen saavuttamiseksi restriktioendonukleaasit integroidaan erilaisiin molekyylibiologiaprotokolliin. Esimerkiksi yksittäinen geeni voidaan siepata ja replikoida tulevaa analyysiä varten. Tätä prosessia kutsutaan geenin "kloonaamiseksi".

Rajoitusfragmenttien pituuden polymorfismi (RFLP)

Restriktiofragmenttien pituuden polymorfismit viittaavat spesifisiin nukleotidisekvensseihin DNA: ssa, jotka restriktioendonukleaasit kykenevät tunnistamaan ja leikkaamaan.

Entsyymien spesifisyyden ansiosta jokaiselle organismille on tunnusomaista DNA: n spesifinen leikkauskuvio, joka saa alkunsa fragmentit, joiden pituus on vaihteleva.

Restriktioendonukleaasien tyypit

Historiallisesti restriktioendonukleaasit on luokiteltu kolmeen entsyymityyppiin, jotka on merkitty roomalaisilla numeroilla. Äskettäin on kuvattu neljäs tyyppi endonukleaasia.

Tyyppi I

Tyypin I endonukleaasien tärkein ominaisuus on, että ne ovat proteiineja, jotka koostuvat useista alayksiköistä. Jokainen näistä toimii yhtenä proteiinikompleksina ja sisältää yleensä kaksi alayksikköä nimeltään R, kaksi M ja yksi S.

S-osa on vastuussa restriktiokohdan tunnistamisesta DNA: ssa. R-alayksikkö puolestaan ​​on välttämätöntä pilkkomiseen ja M on vastuussa metylointireaktion katalysoinnista.

Tyypin I entsyymejä, joita tunnetaan kirjaimilla A, B, C ja D, on neljä alaluokkaa, jotka ovat yleisesti käytössä. Tämä luokittelu perustuu geneettiseen komplementointiin.

Tyypin I entsyymit olivat ensimmäisiä restriktioendonukleaaseja, jotka löydettiin ja puhdistettiin. Hyödyllisimmät molekyylibiologiassa ovat kuitenkin tyyppi II, jota kuvataan seuraavassa osassa.

Tyyppi II

Tyypin II restriktioendonukleaasit tunnistavat spesifiset DNA-sekvenssit ja pilkkoutumisen vakioasennossa lähellä sekvenssiä, joka tuottaa 5'-fosfaatteja ja 3'-hydroksyyliä. Ne vaativat yleensä kofaktoreina magnesiumioneja (Mg ²⁺), mutta on joitain, joilla on paljon tarkempia vaatimuksia.

Rakenteellisesti ne voivat esiintyä monomeereinä, dimeereinä tai jopa tetrameereinä. Rekombinantti tekniikka käyttää tyypin II endonukleaaseja, ja tästä syystä on karakterisoitu yli 3500 entsyymiä.

Tyyppi III

Nämä entsymaattiset järjestelmät koostuvat kahdesta geenistä, nimeltään mod ja res, jotka koodittavat DNA: n tunnistavat alayksiköt ja modifikaatiot tai rajoitukset. Molemmat alayksiköt ovat välttämättömiä restriktioon, prosessi, joka riippuu täysin ATP-hydrolyysistä.

DNA-molekyylin katkaisemiseksi entsyymin on oltava vuorovaikutuksessa kahden kopion kanssa ei-palindromisesta tunnistussekvenssistä, ja kohtien on oltava käänteissuunnassa substraatista. Lohkaisua edeltää DNA: n translokaatio.

Tyyppi IV

Lisäryhmä on tunnistettu viime aikoina. Järjestelmä koostuu kahdesta tai useammasta geenistä, jotka koodaavat proteiineja, jotka katkaisevat vain modifioidut DNA-sekvenssit, joko metyloidut, hydroksimetyloidut tai hydrometyloidut glukosyyli.

Esimerkiksi EckKMcrBC-entsyymi tunnistaa kaksi dinukleotidia, joiden yleinen muoto on RmC; puriini, jota seuraa metyloitu sytosiini, joka voidaan erottaa useilla emäsparilla - 40: stä lähes 3000: een. Pilkkominen tapahtuu noin 30 emäsparia sen kohdan jälkeen, jonka entsyymi tunnistaa.

Tyypin V endonukleaasit

Tämän tyyppisiä endonukleaaseja kutsutaan myös "homing" endonukleaaseiksi. Nämä entsyymit tunnistavat ja leikkaavat kohde-DNA-sekvenssin genomin ainutlaatuisissa kohdissa 14 - 40 bp.

Nämä entsyymit koodataan usein introneihin ja niiden toiminnan uskotaan edistävän katkaistujen sekvenssien horisontaalista siirtymistä. Leikkaamisen jälkeen DNA-kaksoiskierroksessa tapahtuu katkeamiskorjaus komplementaarisen sekvenssin perusteella.

esimerkit

E. colista peräisin oleva endonukleaasi I toimii puolustusjärjestelmänä faagia ja loisia vastaan. Se sijaitsee pääasiassa sytoplasmisen kalvon ja soluseinämän välillä. Se tuottaa kaksijuosteisia katkoja vieraassa DNA: ssa, jonka kanssa se on vuorovaikutuksessa periplasmisessa tilassa.

CRISPR-Cas-endonukleaasit ovat entsyymejä, jotka vaikuttavat monentyyppisten bakteerien puolustusmekanismeihin. Ne tunnistavat ja leikkaavat spesifiset DNA-sekvenssit tunkeutuvista organismeista, jotka ovat yleensä viruksia.

Äskettäin Massachusetts Institute of Technology (MIT) tutkijat löysivät CRISPR-Cas12bm-genomin editointijärjestelmän erittäin tarkasti ihmisen solujen modifioimiseksi.

Viitteet

1. Burrell, MM (toim.). (1993). Molekyylibiologian entsyymit. Totowa, NJ: Humana Press.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA ja Wilson, GG (2013). Tyypin I restriktioentsyymit ja niiden sukulaiset. Nukleiinihappojen tutkimus, 42 (1), 20 - 44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS ja Pfaller, MA (2017). Lääketieteellinen mikrobiologia + espanjaksi tarkoitettu StudentConsult + StudentConsult. Elsevier terveystieteet.
4. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restriktioendonukleaasit DNA-molekyylien analysoinnissa ja uudelleenjärjestelyissä. Biokemian vuosikatsaus, 44 (1), 273 - 293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., ja Wende, W. (2005). Tyypin II restriktioendonukleaasit: rakenne ja mekanismi. Solu- ja molekyylitieteet, 62 (6), 685.