RAJOITTAVAT ENTSYYMIT: TOIMINNOT, TYYPIT JA ESIMERKIT - BIOLOGIA

Restriktioentsyymit ovat endonukleaaseja käyttää tiettyjen arkkien ja bakteerien estämiseksi tai "rajoittaa" virusten leviämisen sisällä. Ne ovat erityisen yleisiä bakteereissa ja ovat osa heidän puolustusjärjestelmäänsä vieraita DNA: ta vastaan, joka tunnetaan restriktio- / modifikaatiojärjestelmänä.

Nämä entsyymit katalysoivat kaksikaistaisen DNA: n pilkkoutumista tietyissä kohdissa toistettavasti ja ilman lisäenergian käyttöä. Useimmat vaativat kofaktorien, kuten magnesiumin tai muiden kaksiarvoisten kationien, läsnäolon, vaikka jotkut vaativat myös ATP- tai S-adenosyylimetioniinia.

HindIII-restriktioentsyymireaktiokaavio (Lähde: Helixitta Wikimedia Commonsin kautta)

Rajoittavat endonukleaasit löysivät vuonna 1978 Daniel Nathans, Arber Werner ja Hamilton Smith, jotka saivat Nobelin lääketieteellisen palkinnon löytöstään. Niiden nimi johtuu yleensä organismista, missä heitä ensin havaitaan.

Sellaisia entsyymejä käytetään laajasti DNA-kloonausmenetelmien ja muiden molekyylibiologian ja geenitekniikan strategioiden kehittämisessä. Niiden spesifiset sekvenssin tunnistusominaisuudet ja kyky leikata sekvenssejä tunnistuspaikkojen lähellä tekevät niistä tehokkaita työkaluja geneettisissä kokeissa.

Fragmentteja, jotka on tuotettu restriktioentsyymeillä, jotka ovat toimineet tietyssä DNA-molekyylissä, voidaan käyttää alkuperäisen molekyylin "kartan" luomiseen uudelleen käyttämällä tietoja paikoista, joissa entsyymi katkaisee DNA: n.

Joillakin restriktioentsyymeillä voi olla sama tunnistuskohta DNA: ssa, mutta ne eivät välttämättä leikkaa sitä samalla tavalla. Siten on entsyymejä, jotka leikkaavat jättävät tylsät päät, ja entsyymejä, jotka leikkaavat jättäen koheesiopäät, joilla on erilaisia sovelluksia molekyylibiologiassa.

Tällä hetkellä on olemassa satoja erilaisia kaupallisesti saatavia restriktioentsyymejä, joita tarjoavat eri kaupalliset talot; Nämä entsyymit toimivat "räätälöityinä" molekyylisaksoina eri tarkoituksiin.

ominaisuudet

Restriktioentsyymit täyttävät polymeraasien päinvastaisen toiminnan, koska ne hydrolysoivat tai hajottavat esterisidoksen fosfodiesterisidoksessa nukleotidiketjun vierekkäisten nukleotidien välillä.

Molekyylibiologiassa ja geenitekniikassa ne ovat laajalti käytettyjä välineitä ekspressio- ja kloonausvektorien rakentamiseen sekä tiettyjen sekvenssien tunnistamiseen. Ne ovat käyttökelpoisia myös rekombinanttigenomien rakentamisessa ja niillä on suuri bioteknologinen potentiaali.

Viimeaikaiset edut geeniterapiassa hyödyntävät nykyisin restriktioentsyymejä tiettyjen geenien viemiseksi vektoreihin, jotka ovat kuljettimia tällaisten geenien kuljettamiseksi eläviin soluihin ja joilla todennäköisesti on kyky liittää solugenomiin suorittaakseen pysyvät muutokset.

Toimintamekanismi

Restriktioentsyymit voivat katalysoida kaksikaistaista DNA: n pilkkoutumista, vaikka jotkut kykenevät tunnistamaan yksikaistaiset DNA-sekvenssit ja jopa RNA: n. Leikkaus tapahtuu sekvenssien tunnistamisen jälkeen.

Vaikutusmekanismi koostuu kunkin DNA-juosteen luurankoksessa olevan fosfaattiryhmän ja deoksiribroosin välisen fosfodiesterisidoksen hydrolyysistä. Monet entsyymeistä kykenevät leikkaamaan samassa paikassa, jonka tunnistavat, kun taas toiset leikkaavat 5 - 9 emäsparia ennen tai jälkeen sen.

Normaalisti nämä entsyymit leikkaavat fosfaattiryhmän 5'-päässä, aiheuttaen DNA-fragmentteja, joissa on 5'-fosforyylipää ja 3'-terminaalinen hydroksyylipää.

Koska proteiinit eivät ole suorassa kosketuksessa DNA: n tunnistuskohdan kanssa, niitä on siirrettävä peräkkäin, kunnes tietty kohta on saavutettu, ehkä "liukuvien" mekanismien avulla DNA-juosteessa.

Entsymaattisen pilkkomisen aikana kunkin DNA-juosteen fosfodiesterisidos sijoitetaan yhteen restriktioentsyymien aktiivisiin kohtiin. Kun entsyymi poistuu tunnistus- ja pilkkoutumiskohdasta, se tekee sen epäspesifisten ohimenevien assosiaatioiden kautta.

Tyypit

Tällä hetkellä tunnetaan viisi restriktioentsyymityyppiä. Tässä on lyhyt kuvaus jokaisesta:

Tyypin I restriktioentsyymit

Nämä entsyymit ovat suuria pentameerisiä proteiineja, joissa on kolme alayksikköä, yksi restriktioon, toinen metylointiin ja toinen sekvenssin tunnistamiseen DNA: ssa. Nämä endonukleaasit ovat multifunktionaalisia proteiineja, jotka kykenevät katalysoimaan restriktio- ja modifikaatioreaktioita, niillä on ATPaasi-aktiivisuus ja myös DNA-topoisomeraasi.

Tämän tyyppiset entsyymit olivat ensimmäisiä löydettyjä endonukleaaseja, ne puhdistettiin ensin 1960-luvulla ja niitä on tutkittu perusteellisesti siitä lähtien.

Tyypin I entsyymejä ei käytetä laajasti bioteknologisena välineenä, koska pilkkomiskohta voi olla vaihtelevalla etäisyydellä jopa 1000 emäsparia tunnistuspaikasta, mikä tekee niistä epäluotettavia kokeellisen uusittavuuden suhteen.

Tyypin II restriktioentsyymit

Ne ovat entsyymejä, jotka koostuvat homodimeereistä tai tetrameereistä, jotka leikkaavat DNA: ta määritellyissä kohdissa, joiden pituus on 4 - 8 bp. Nämä pilkkoutumiskohdat ovat tyypillisesti palindroomisia, ts. Ne tunnistavat sekvenssit, jotka luetaan samalla tavalla molemmissa suunnissa.

Monet bakteerien tyypin II restriktioentsyymeistä leikkaavat DNA: n, kun he tunnistavat sen vieraan luonteen, koska sillä ei ole tyypillisiä muunnoksia, jotka omalla DNA: lla pitäisi olla.

Nämä ovat yksinkertaisimmat restriktioentsyymit, koska ne eivät vaadi muuta kofaktoria kuin magnesiumia (Mg +) DNA-sekvenssien tunnistamiseksi ja leikkaamiseksi.

Tyypin II restriktioentsyymien tarkkuus tunnistaa ja leikata DNA: n yksinkertaisia sekvenssejä tarkissa paikoissa tekee niistä yhden yleisimmin käytetyistä ja välttämättömistä useimmissa molekyylibiologian haaroissa.

Tyypin II restriktioentsyymien ryhmässä on useita alaluokkia, jotka luokitellaan tiettyjen ominaisuuksien perusteella, jotka ovat ainutlaatuisia jokaiselle. Näiden entsyymien luokittelu tapahtuu lisäämällä aakkosten kirjaimet A: sta Z: een entsyymin nimen jälkeen.

Jotkut alaluokista, jotka tunnetaan parhaiten hyödyllisyydestään, ovat:

Alaluokka IIA

Ne ovat eri alayksiköiden dimeerejä. Ne tunnistavat epäsymmetriset sekvenssit ja niitä käytetään ihanteellisina esiasteina leikkausentsyymien tuottamiseen.

Alaluokka IIB

Ne koostuvat yhdestä tai useammasta dimeeristä ja leikkaavat DNA: ta tunnistussekvenssin molemmille puolille. He leikkaavat molemmat DNA-juosteet emäsparin välin tunnistuskohtaa eteenpäin.

Alaluokka IIC

Tämän tyyppiset entsyymit ovat polypeptidejä, joilla on DNA-juosteiden jakautumisen ja modifioinnin toiminnot. Nämä entsyymit leikkaavat molemmat juosteet epäsymmetrisesti.

Alaluokka IIE

Tämän alaluokan entsyymejä käytetään eniten geenitekniikassa. Heillä on katalyyttinen kohta ja yleensä ne vaativat allosteerisen efektorin. Näiden entsyymien on oltava vuorovaikutuksessa tunnistussekvenssin kahden kopion kanssa tehokkaan katkaisun suorittamiseksi. Tämän alaluokan sisällä ovat entsyymit EcoRII ja EcoRI.

Tyypin III restriktioentsyymit

Tyypin III restriktioendonukleaasit koostuvat vain kahdesta alayksiköstä, toinen vastaa DNA: n tunnistamisesta ja modifioinnista, kun taas toinen vastaa sekvenssin pilkkomisesta.

Nämä entsyymit tarvitsevat toiminnalleen kaksi kofaktoria: ATP ja magnesium. Tämän tyyppisillä restriktioentsyymeillä on kaksi epäsymmetristä tunnistuskohtaa, ne siirtävät DNA: ta ATP: stä riippuvalla tavalla ja leikkaavat sen 20-30 bp: n välille tunnistuskohdan vieressä.

Tyypin IV restriktioentsyymit

Tyypin IV entsyymit on helppo tunnistaa, koska ne leikkaavat DNA: n metylaatiomerkeillä, ne koostuvat useista eri alayksiköistä, jotka vastaavat DNA-sekvenssin tunnistamisesta ja leikkaamisesta. Nämä entsyymit käyttävät GTP: tä ja kaksiarvoista magnesiumia kofaktoreina.

Spesifisiin pilkkoutumiskohtiin sisältyvät nukleotidiketjut, joissa on metyloituja tai hydroksimetyloituja sytosiinitähteitä nukleiinihappojen yhdellä tai molemmilla juosteilla.

Tyypin V restriktioentsyymit

Tämä luokittelu ryhmittelee CRISPER-Cas-tyyppiset entsyymit, jotka tunnistavat ja leikkaavat tunkeutuvien organismien spesifiset DNA-sekvenssit. Cas-entsyymit käyttävät CRISPER-syntetisoidun ohjaus-RNA: n juostetta tunkeutuvien organismien tunnistamiseksi ja hyökkäämiseksi.

Entsyymit, jotka luokitellaan tyypiksi V, ovat polypeptidejä, jotka on jäsennelty tyypin I, II ja II entsyymien perusteella. Ne voivat leikata DNA: n osia melkein mistä tahansa organismista ja laajalla pituudella. Niiden joustavuus ja helppokäyttöisyys tekevät näistä entsyymeistä yhden tyypin II entsyymien ohella nykyään yleisimmin käytettyjä välineitä geenitekniikassa.

esimerkit

Restriktioentsyymejä on käytetty DNA: n polymorfismien havaitsemiseksi, erityisesti populaatioiden geenitutkimuksissa ja evoluutiokokeissa, joissa käytetään mitokondriaalista DNA: ta, jotta saadaan tietoa nukleotidisubstituutioiden nopeudesta.

Tällä hetkellä bakteereihin transformaatioon eri tarkoituksiin käytetyillä vektoreilla on monikloonauskohtia, joissa löydetään tunnistuskohtia monille restriktioentsyymeille.

Näistä entsyymeistä suosituimpia ovat EcoRI, II, III, IV ja V, jotka on saatu ja kuvattu ensimmäistä kertaa E. colista; HindIII H. influenzaesta ja BamHI B. amyloliquefaciensista.

Viitteet

Bickle, TA, ja Kruger, DH (1993). DNA-restriktion biologia. Mikrobiologiset arvostelut, 57 (2), 434–450.
Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, ja Horvath, P. (2007). CRISPR tarjoaa hankitun vastustuskyvyn viruksille prokaryooteissa. Science, 315 (maaliskuu), 1709–1713.
Goodsell, D. (2002). Molekyylinäkökulma: Restriktioendonukleaasit. Kantasolujen syöpälääketieteen perusteet, 20, 190–191.
Halford, SE (2001). Hyppääminen, hyppääminen ja silmukointi restriktioentsyymeillä. Biochemical Society Transactions, 29, 363 - 373.
Jeltsch, A. (2003). Laji-identiteetin ylläpitäminen ja bakteerien spesifikaation hallinta: uusi tehtävä restriktio- / modifiointijärjestelmille? Gene, 317, 13-16.
Krebs, J., Goldstein, E., ja Kilpatrick, S. (2018). Lewinin geenit XII (12 painos). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… She, Q. (2015). Valmistamalla tyypin I ja tyypin CRISPR-Cas järjestelmät genomin muokkaamiseen. Nukleiinihappojen tutkimus, 1–12.
Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA ja Wilson, GG (2013). Tyypin I restriktioentsyymit ja niiden sukulaiset. Nukleiinihappojen tutkimus, 1–25.
Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restriktioendonukleaasit DNA-molekyylien analysoinnissa ja uudelleenjärjestelyissä. Annu. Biochem., 273–293.
Nei, M., ja Tajima, F. (1981). Dna-polymorfismi, joka voidaan havaita restriktioendonukleaaseilla. Genetiikka, 145 - 163.
Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., ja Wende, W. (2005). Solun ja molekyylin biotieteiden tyypin II restriktioendonukleaasit: rakenne ja mekanismi. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685–707.
Roberts, R. (2005). Kuinka restriktioentsyymeistä tuli molekyylibiologian työhevosia. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
Roberts, RJ, ja Murray, K. (1976). Restriktioendonukleaasit. Kriittiset arvostelut biokemiassa, (marraskuu), 123-164.
Stoddard, BL (2005). Kodittavan endonukleaasin rakenne ja toiminta. Biofysiikan neljännesvuosittaiset katsaukset, 1–47.
Tock, MR, ja Dryden, DTF (2005). Restriktion ja anti-restriktion biologia. Nykyinen lausunto mikrobiologiassa, 8, 466–472.
Wilson, GG, ja Murray, NE (1991). Rajoitus- ja muutosjärjestelmät. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.
Wu, Z., ja Mou, K. (2016). Genomitutkimukset Campylobacter jejuni -virulenssiin ja populaatiogenetiikkaan. Immun. Dis. Muunto. Med., 2 (3), 109–119.
Yuan, R. (1981). Monitoimisten restriktioendonukleaasien rakenne ja mekanismi. Annu. Biochem., 50, 285-315.

RAJOITTAVAT ENTSYYMIT: TOIMINNOT, TYYPIT JA ESIMERKIT - BIOLOGIA - 2026