BAKTEERIMUSTA: OMINAISUUDET JA VALMISTELU - BIOLOGIA - 2025

Bakteerien preparaatti on ohut kalvo preparaatti suspensiota bakteeri mikro-organismeja, on tehty läpinäkyvä lasilevy tai dia, tarkkailuun valomikroskoopilla.

Pidennys kalvon muodossa suoritetaan mikro-organismien erottamiseksi mahdollisimman paljon, koska havainto ei ole selkeä, jos ne ryhmitellään.

Kuva 1. Bakteerivaaka, joka on havaittu skannaavalla elektronimikroskoopilla. Lähde: pixbay.com

Bakteeriviljelmien tutkimuksessa niiden analysoimiseksi paremmin käytetään levien valmistelu-, kiinnitys- ja värjäysmenetelmiä. Koska mikro-organismit ovat pieniä, niiden havaitsemiseksi tarvitaan välttämättä optinen mikroskooppi.

Optiset mikroskoopit ovat välttämättömiä välineitä särmien havaitsemiseksi. Ne käyttävät optisia linssejä ja valoa, joka mahdollistaa näytteiden katsomisen suurella suurennuksella.

Elävillä soluilla ei yleensä ole enimmäkseen värillisiä rakenteita, valomikroskoopilla katsottuna ne ovat värittömiä, läpinäkyviä näytteitä ja niillä on hyvin pieni sisäinen kontrasti ja ympäristönsä kanssa.

Havaitseminen yksinkertaisella kirkkaan kentän optisella mikroskoopilla, ilman lisävärjäystekniikoita, on hyvin rajallista, ja sitä käytetään vain joissakin tapauksissa, kuten esimerkiksi mikro-organismien liikkeen havainnoinnissa.

Mikro-organismien optimaaliseen havaitsemiseen on löydettävä tasapaino kontrastin ja resoluution välillä. Solutietoja ei voida nähdä mikroskoopilla, jopa korkealla resoluutiolla; Väriaineiden käyttö vaaditaan värjäystekniikoilla, jotka tarjoavat kontrastin havainnoinnille.

Hyvälaatuisen bakteerimusta ominaisuudet

Erinomainen kontrasti

Erinomaisen kontrastin saavuttamiseksi on olemassa hienostuneita mikroskooppeja, joita kutsutaan vaihekontrastimikroskoopeiksi, differentiaalisten häiriöiden mikroskoopeiksi ja tummakenttämikroskoopeiksi. Tämän tyyppistä mikroskooppia käytetään tarkkailemaan muun muassa bakteerirakenteita, kuten kuoria ja säikeitä.

Värjäys on yksinkertainen tekniikka kontrastin lisäämiseksi, joka saavutetaan kirkkaan kentän mikroskoopilla. Tässä tekniikassa voidaan käyttää erilaisia ​​tahroja, jotka parantavat merkittävästi mikroskooppista havainnointia.

Värjäykset suoritetaan suoraan dioilla olevien mikro-organismisuspensioiden leviämisille tai jatkeille, aiemmin kuivatut ja kiinnitetyt.

Hyvä korjaus

Kiinnitys on tekniikka, jota käytetään solurakenteiden säilyttämiseen; aiheuttaa mikro-organismien inaktivoitumisen ja tarttumisen objektilasin lasiin. Kiinnityskäsittelyjä on erilaisia: lämpökiinnitys ja kemiallinen kiinnitys.

Lämmön kiinnitys

Tämä on yleisimmin käytetty menetelmä bakteerien määritykseen. Tekniikka koostuu kulkeutuneen bakteerisuspension kuljettamisesta sytyttimen liekin läpi. Tämä tekniikka pystyy säilyttämään bakteerien ulkoisen morfologian, mutta tuhoaa niiden sisäiset rakenteet.

Kemiallinen kiinnitys

Kemiallisessa kiinnityksessä käytetään muun muassa säilöntäkemikaaleja, kuten formaldehydiä tai formaliinia, etanolia ja etikkahappoa. Kemiallisten kiinnitysaineiden käytön etuna on, että mikro-organismien sisäiset solurakenteet säilyvät.

Kuva 2. Veren tahri. Lähde: Bobjgalindo, Wikimedia Commonsista

Hyvä värjäys

Yleisimmät menetelmät aikaisemmin kuivatun ja kiinteän musteen värjämiseksi ovat positiivinen tai yksinkertainen värjäys, differentiaalinen värjäys ja negatiivinen värjäys. Lisäksi on olemassa erityisiä tekniikoita tiettyjen solurakenteiden (kapseli, itiö, siipi) värjäämiseksi.

Positiivinen tai yksinkertainen värjäys

Positiivinen tai yksinkertainen värjäys on laajimmin käytetty sivellin värjäystekniikka. Se käyttää väriaineita, jotka kykenevät sitoutumaan tiettyihin mikrobirakenteisiin, jolloin ne voidaan havaita mikroskoopilla.

Näillä väriaineilla on kromoforiryhmät (värillinen osa) kemiallisessa rakenteessaan vuorotellen kaksoissidoksilla ja yksisidoksilla (konjugaatio). Nämä sidokset voivat puolestaan ​​muodostaa ionisia tai kovalenttisia sidoksia joidenkin solurakenteiden kanssa.

Positiivisessa tai yksinkertaisessa värjäyksessä käytetyt väriaineet ovat enimmäkseen aniliinin kemiallisia johdannaisia ​​(värilliset orgaaniset suolat).

Toisaalta väriaineista voimme löytää jotkut, joilla on emäksinen pH, ja toiset happamalla.

Perusväriaineet

Perusväriaineissa kromoforiryhmällä on positiivinen sähkövaraus. Suurimmalla osalla prokaryoottisista mikro-organismeista on neutraali sisäinen pH, ja niiden solupinta on negatiivisesti varautunut. Tämän sähköstaattisen vuorovaikutuksen kautta kromofori sitoutuu soluun ja värjää sen.

Esimerkkejä emäksisistä väriaineista ovat mm. Metyleenisininen, kristalli violetti, malakiittivihreä, emäksinen fussiini, safraniini.

Hapan väriaineet

Happoväreissä kromoforiryhmällä on negatiivinen sähkövaraus. Näitä käytetään värjäämään proteiineja, joissa on positiivisesti varautuneita aminoryhmiä. Esimerkkejä happoväreistä ovat happofussiini, ruusu-bengaali, Kongon punainen ja eosiini.

Differentiaalinen värjäys

Erovärjäystekniikka koostuu kahden värin tai intensiteetin väriaineen levittämisestä erilaisten mikro-organismien erottamiseksi mikroskoopin alla. Gram- ja happo-alkoholiresistenssitahrat ovat bakteriologiassa yleisimmin käytettyjä differentiaalitahroja.

Gram-värjäystä käytetään alustavana testinä muodon, koon, soluryhmän ja soluseinän tyypin tuntemiseksi. Gram-värjäystestin avulla soluseinämän bakteerit luokitellaan gram-positiivisiksi bakteereiksi ja gram-negatiivisiksi bakteereiksi.

Negatiivinen värjäys

Tässä tekniikassa käytetään kemiallisia väriaineita, jotka eivät tunkeudu solun sisäpuolelle, mutta tekevät väliaineen, jossa mikro-organismit esiintyvät mustana taustana.

Negatiivisessa värjäystekniikassa pestys tehdään tipalla intialaista mustetta tai nigrosiinisuspensiota, joka huoneenlämpötilassa kuivaamisen jälkeen antaa läpinäkymättömän kalvon valon läpi. Tällä tavalla mikro-organismit näkyvät kirkkaina muodoina tummalla taustalla.

Valmistautuminen

A. Haju

1.- Pese levyt erittäin hyvin, kuivaa imukykyisellä paperilla ja merkitse ne. Etiketissä on ilmoitettava valmisteen sisältö, päivämäärä ja valmisteen valmistajan nimi.

2.- Valaisin sytytetään ja steriloidaan inokulaatiosilmukka liekissä, kunnes kirkkaan punainen.

3.- Anna kahvan jäähtyä.

4.- Ota bakteeriviljelyputki, poista korkki ja siirrä putken suu nopeasti polttimen liekin (liekin) läheisyyteen.

5.- Aseta inokulaatiosilmukka putkeen, joka sisältää bakteeriviljelmän, ja ota näyte.

6.- Jos viljely on nestemäistä väliainetta, aseta kahvalla otettu näyte näytteen keskelle ja levitä se varovasti halkaisijaltaan noin 2 cm: n ympyrään.

7.- Steriloi inokulaatiosilmukka uudelleen.

8.- Anna kerroksen kuivua ilmassa.

9.- Toista vaiheet 3–8 kolme kertaa.

10.- Jos viljely on kiinteässä väliaineessa, dioille on asetettava aiemmin tippa tislattua vettä. Tämä tehdään sekoittamaan pieni näyte viljelmästä, joka on otettu inokulaatiosilmukkaan, vaiheiden 2 - 5 ohjeiden mukaisesti (aseptiset olosuhteet).

11.- Levitä laimennettu näyte vesipisaralla objektilasille ja toista kolme kertaa.

B. Kiinnitys

1.- Lisää kaksi tippaa metanolia tai absoluuttista etanolia kuivapeitteihin - nestemäisessä väliaineessa viljelmistä.

2.- Anna ilman kuivua pois sytyttimestä.

3.- Jos rasva on peräisin viljelmästä kiinteässä väliaineessa, kuiva tahna kiinnitetään lämmöllä, kuljettamalla se nopeasti 2-3 kertaa kevyemmän liekin kuumin osa.

4.- Kosketa maidon alaosaa vasemman käden selkäosalla (oikeakätiset; muuten käytä oikeaa kättä) ja tarkista, että se on kylmä.

C. Yksinkertainen värjäys

1.- Lisää 2 tippaa valittua tahraa uppoon ja anna vaikuttaa niin kauan kuin erityisissä protokolloissa kullekin tahralle asetetaan (yleensä välillä 1-5 minuuttia).

2.- Jotkut tahrat vaativat lämmön käyttämistä aktivoitumiseen, jolloin on tarpeen olla erityisen varovainen kuumentaessasi liuskaa kevyemmässä liekissä (käsittele sitä pinsetteillä ja vältä kiehumista). Umpin ylikuumeneminen voi tuhota havaitut solut.

3.- Poista ylimääräinen väriaine pesemällä tislatulla vedellä piketistä. Poista pesuvesi napauttamalla kevyesti liuosta sen reunalla, kallistettuna työpöydälle.

4.- Anna kuivua ilmassa.

5.- Havaintotyypistä riippuen tässä vaiheessa käytetään vai ei. Suojapeite suojaa ja säilyttää tahran. Jos tässä vaiheessa tehdään öljykastehavainto, ei käytetä peitelasia, mutta leviä ei voida säilyttää.

D. Laastarin lopullinen säilyvyys

1.- Upota uppoa peräkkäin jokaisessa jäljempänä mainitussa liuoksessa vähintään 5 minuutin ajan. Näiden "kylpyjen" tarkoituksena on kuivattaa tahra kokonaan. Jokainen reagenssi on tyhjennettävä perusteellisesti ennen levityksen lisäämistä seuraavaan kylpyyn.

Kuivatuskylpyjen järjestys on seuraava:

1. 70% etanolia
2. 95% etanolia
3. Puhdas asetoni
4. Asetoni-ksyloli-seos 1: 1
5. Ksyloli

Anna sitten kuivua.

2.- Asenna suojus, mieluiten 22 × 22 mm, Kanada-balsamilla tai muulla kiinnitysvälineellä.

Viitteet

1. Briggs, G. (1965). Syy-tekijät mikrobiologisissa laboratorio-onnettomuuksissa ja -infektioissa. Yhdysvaltain armeijan biologiset laboratoriot. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG ja Welch, CT (2017). Mikrobiologia: laboratoriokäsikirja. Pearson.
3. Holt, JG-toimittaja. (1977). Lyhyempi Bergeyn käsikirja determinatiivisesta bakteriologiasta. 8 ^th Baltimore: Williams ja Wilkins Co.
4. Johnson, TR ja Case; CL (2018). Laboratoriokokeet mikrobiologiassa. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Diagnostinen mikrobiologia. 14 ^th St. Louis, USA: Elsiever, Inc.