GRAM-TAHRA: PERUSTEET, MATERIAALIT, TEKNIIKKA JA KÄYTTÖTAVAT - BIOLOGIA - 2025

Gram-värjäys on yksinkertaisin ja käyttökelpoinen värjäys tekniikka diagnostisissa mikrobiologian. Tämän tekniikan on luonut tanskalainen lääkäri Hans Christian Gram vuonna 1884, joka onnistui luokittelemaan bakteerit gram-positiivisiksi ja gram-negatiivisiksi soluseinän koostumuksen mukaan.

Hucker teki tietyt tekniikat tietyissä modifikaatioissa vuonna 1921 reagenssien stabiloimiseksi ja värjäyksen laadun parantamiseksi, minkä vuoksi Gram-värjäys tunnetaan myös nimellä Gram-Hucker.

Erilaiset levyt, jotka on värjätty Gram-värjäyksellä. A. Gram-positiiviset kokit. B. Gram-negatiiviset sauvat. C. Gram-positiiviset, polymorphonuclear ja mononuclear bacilat. D. Hiivat.

Tällä tekniikalla on myös mahdollista tarkkailla muun muassa mikro-organismien muotoa, ts. Jos ne ovat kokkeja, baciileja, coccobacilli-bakteereja, pleomorfisia, rihmamaisia. Sen lisäksi, että se jakautuu avaruudessa: klusterissa, ketjussa, eristettynä, pareittain, tetradeissa jne.

Kun epäillään bakteeri-infektiota, suurin osa vastaanotetuista näytteistä on leikattava objektilasille ja värjättävä grammalla grammaa mikroskooppista tutkimusta varten.

Gram-raportti opastaa lääkäriä siihen, minkä tyyppiset mikro-organismit voivat aiheuttaa infektion, ennen lopullisen viljelytuloksen saamista.

Joissakin tapauksissa potilaan elämä on hyvin vaarannettu, joten lääkärit tarvitsevat kiireellisesti Gram-raporttia empiirisen hoidon aloittamiseksi odottaessaan mikro-organismin tunnistamista.

Esimerkiksi, jos grammi paljastaa, että aivo-selkäydinnesteessä on gram-positiivisia kokkeja, lääkäri ohjaa alkuhoitoa antibiooteilla, jotka poistavat tämän tyyppiset bakteerit, tätä varten vahvistettujen ohjeiden mukaisesti.

Kun lopullinen tulos on saatu eristetyn mikro-organismin nimellä ja sen vastaavalla antibiogrammilla, lääkäri arvioi vai muuttaako hoitoa vai ei. Tämä päätös tehdään tutkimuksen mukaan mikro-organismin alttiudesta vastaanottamilleen antibiooteille ja potilaan kehitykselle.

Perusta

Tämä on tekniikka, jolla on 4 perustavaa vaihetta: värjäys, kiinnitys peitteellä, värinmuutos ja maalivärjäys. Siksi tämä tekniikka mahdollistaa bakteerien värjäyksen lisäksi myös niiden erilaistumisen.

Kristalli violetti on ensimmäinen käytetty väriaine. Sillä on affiniteetti peptidoglykaaniin ja se värjää kaikki läsnä olevat bakteerit purppuranpunaisena, myöhemmin asetetaan lugoli, joka toimii peiteaineena, ts. Se indusoi liukenemattomien kide violetti-jodikompleksien - ribonukleaaristen proteiinien - muodostumisen soluun..

Gram-positiiviset bakteerit, joilla on paksu peptidoglykaaniseinä, muodostavat monimutkaisempia komplekseja (kidevioletti-jodi), joten ne säilyttävät väriaineen.

Lisäksi se vaikuttaa myös siihen, että grampositiivisten bakteerien seinämä sisältää suuremman määrän tyydyttymättömiä happoja, joilla on suuri affiniteetti hapettimiin (Lugol).

Samaan aikaan gram-negatiivisissa bakteereissa on ohut kerros peptidoglykaania, mikä saa bakteerit muodostamaan vähemmän komplekseja kuin gram-positiiviset.

Sitten tulee värivaihe, jossa gram-positiiviset ja gram-negatiiviset bakteerit käyttäytyvät eri tavalla.

Gramnegatiiviset bakteerit sisältävät lipopolysakkarideja sisältävän ulkomembraanin, joka on osa niiden soluseinää. Rasvat tuhoutuvat kosketuksessa asetonialkoholin kanssa, joten ulkomembraani destabilisoituu, vapauttaen violetti kide.

Näin se torjutaan safraniinilla tai emäksisellä fuksinilla, joka muuttuu punaiseksi.

Gram-positiivisten bakteerien tapauksessa ne kestävät haalistumista, koska valkaisuaine toimii sulkemalla huokoset ja estäen kidevioletti / jodi -kompleksia vuotamasta.

Siksi väri kidevioletin kanssa pysyy vakaana eikä safraniinille tai fuksinille ole tilaa. Siksi nämä bakteerit värjäävät syvän siniseksi tai violetiksi.

tarvikkeet

Gramin värjäyssarja koostuu:

• Violetti lasi
• Lugolin
• Asetonialkoholi
• Safraniini tai emäksinen fuksiini

Väriaineiden ja reagenssien valmistus

Kristalli violetti liuos

Ratkaisu:

Violetti kide ------------- 2 gr

Etyylialkoholi 95% ---------- 20 cc

Ratkaisu B:

Ammoniumoksalaatti ----------- 0,8 gr

Tislattu vesi ------------- 80 cm3

Kristallivioletin lopullista valmistelua varten liuos A on laimennettava 1:10 tislatulla vedellä ja sekoitettava 4 osan liuokseen B. Seosta säilytetään 24 tuntia ennen käyttöä. Suodata keltaisen värjäyspullossa suodatinpaperilla.

Päivittäin käytettävä määrä siirretään meripihkan tiputuspulloon.

Jodi-Lugolin

Punnitaan ja mitataan kunkin yhdisteen ilmoitettu määrä seuraavasti:

Jodikiteet ------------- 1gr

Kaliumjodidi ------------- 2gr

Tislattu vesi ------------- 300 cm3

Kaliumjodidi liukenee vähitellen veteen ja sitten lisätään jodia. Liuos ajellaan keltaiseen pulloon.

Päivittäin käytettävä määrä siirretään pienemmälle meripihkan pullolle tiputuksella.

valkaisu

95% etyylialkoholia -----------– 50 ml

Asetoni ------------------ 50 ml

Se on valmistettu yhtä suureksi osaksi. Peitä hyvin, koska sillä on taipumus haihtua.

Aseta tiputuspulloon.

Tämä valmiste antaa värimuutoksen kohtuullisessa ajassa 5-10 sekuntia ja on suositeltavin.

Aloittelijat käyttävät mieluummin vain 95-prosenttista etyylialkoholia, jossa haalistuminen on hitaampaa kuin 10 - 30 sekuntia.

Vaikka kokeneemmat voivat käyttää puhdasta asetonia, jossa värinmuutos tapahtuu erittäin nopeasti 1-5 sekunnista.

Kontrasti

Safranin-kantaratkaisu

Safranina -------------– 2,5 gr

Etyylialkoholi 95% --------– 100 cm3

Punnittuaan ilmoitetun määrän safraniinia, se liuotetaan 100 ml: aan 95-prosenttista etyylialkoholia.

Toimiva safraniiniliuos valmistetaan kantaliuosta.

Mittaa 10 cm3 kantaliuosta, lisää 90 cc tislattua vettä, jotta saadaan 100 ml.

On suositeltavaa siirtää päivittäin käytettävä määrä keltaiseen pulloon, jossa on tiputin.

Mikro-organismit, jotka värjäävät heikosti gram-negatiivisesti Gram-Hucker-värjäyksellä, kuten tietyt anaerobit, Legionella sp, Campylobacter sp ja Brucella sp, voidaan värjätä paljon paremmin käyttämällä Kopeloffin muutosta Gram-Hucker värjäykseen, nimeltään Gram-Kopeloff -värjäys.

Tämä tekniikka muuttaa safraniinivärin emäksiseksi fuksiiniksi. Tällä modifikaatiolla on mahdollista värjätä tehokkaasti edellä mainitut mikro-organismit.

Reagenssin varastointi

Valmistettuja väriaineita tulee varastoida huoneenlämpötilassa.

Värjättävän näytteen leviämisen valmistelu

Näyte on oltava vähintään 10 ⁵ mikro-organismit ennen havainto mikro-organismi preparaatti on todennäköistä. Levyt voidaan tehdä suorasta näytteestä tai viljelmistä kiinteissä tai nestemäisissä väliaineissa.

Päällysteiden tulee olla tasaisia, hyvin jakautuneita eikä liian paksuja, jotta läsnä olevat rakenteet saadaan paremmin näkyviin.

-Grami suoria näytteitä

Gramma suodattamatonta virtsaa

Virtsa sekoitetaan ja 10 ui laitetaan objektilasille. Ainakin yhden bakteerin / Dip-kentän havaitseminen osoittaa infektion olevan.

Tämä tarkoittaa sitä, että viljelmä on enemmän kuin noin 100000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / ml) Virtsan 85%: ssa tapauksista.

Tämä menetelmä ei ole käyttökelpoinen pesäkkeiden määrän ollessa alle 100 000 CFU.

CSF Gram

CSF tulisi sentrifugoida, supernatantti poistaa ja pelletti levittää objektilasille. Tämä neste on steriili normaaleissa olosuhteissa; bakteerien havaitseminen osoittaa tartunnan.

Gramma hengitysnäytteitä

Yskon, keuhkoputken tai keuhkoputken suulakevesi Gram, vaikka siinä voi olla erilaisia ​​mikro-organismeja, ohjaa aina diagnoosia, sen lisäksi, että se on hyödyllinen havaittujen solutyyppien kohdalla.

Ysköksen tapauksessa levä on valmistettava näytteen märkimmäisillä osilla.

Gramma ulosteesta

Ei ole suositeltavaa suorittaa grammaa tämäntyyppisille näytteille, koska sillä ei ole diagnoosiarvoa.

-Grammaa satoa

Ne voidaan tehdä kahdella tavalla: yksi nestemäisistä viljelmistä ja toinen kiinteistä viljelmistä.

Nestemäiset viljelmät

Nestemäisistä viljelmistä se on erittäin yksinkertainen; Useita sameaisen liemian paistoja otetaan polttimen alle ja asetetaan puhtaalle ja kuivalle levylle tekemällä pyöreitä liikkeitä keskustasta reunaan materiaalin jakamiseksi tasaisesti.

Anna sen kuivua spontaanisti ilmassa. Kuivattuaan materiaali kiinnitetään arkkiin kuumuudella. Tätä varten arkki johdetaan pinsetin avulla 3 - 4 kertaa Bunsen-polttimen liekin läpi huolehtien siitä, että materiaali ei pala.

Arkin annetaan jäähtyä ja se asetetaan värisiltaan.

Kiinteät kasvit

Suoritetaan tahra Gram-tahralle kiinteästä viljelmästä seuraavasti:

Ennen otettavien pesäkkeiden valintaa, objektilasi tulisi valmistaa asettamalla noin kaksi tippaa steriiliä fysiologista suolaliuosta.

Jos alkuperäinen viljelylevy sisältää useita erityyppisiä pesäkkeitä, kummankin eristetty pesäke valitaan suorittamaan grammaa. Jokainen pesäke otetaan platina-silmukan kanssa liuottamiseksi suolaliuokseen, joka oli aikaisemmin asetettu objektilasille.

Pyöreitä liikkeitä tehdään keskustasta reunaa kohti siirtomaan jakamiseksi tasaisesti objektilasilla.

Anna sen kuivua spontaanisti ilmassa. Kuivattuaan arkki kiinnitetään kuumuudella, kuten aiemmin selitettiin (palamalla liuku sytyttimellä) huolehtien siitä, että materiaali ei pala.

Tämä toimenpide on tehtävä kunkin erityyppisen pesäkkeen kanssa. Paperipaperille on huomattava havaittujen järjestys, esimerkiksi:

Pesäke 1: Beeta-hemolyyttinen keltainen pesäke: Gram-positiivisia kokkejä havaittiin klustereissa

Pesäke 2: Kermanvärinen pesäke, ilman hemolyysiä: Havaittiin gram-negatiivisia kookosbakteileja.

Jokainen dio on merkittävä, jotta tiedämme mitä havaitsemme.

Tekniikka

Gram-värjäystekniikka on erittäin helppo suorittaa ja suhteellisen edullinen, eikä sitä voida jättää huomiotta mikrobiologisessa laboratoriossa.

Se tehdään seuraavasti:

1. Kiinnitä sively kuumuudella ja aseta värisiltaan.
2. Peitä objektilasi kokonaan kristallivioletilla yhden minuutin ajan.
3. Pese vedellä Älä kuivaa
4. Peitä arkki lugol-liuoksella, anna vaikuttaa 1 minuutti. Pese vedellä Älä kuivaa.
5. Valkaisua tehdään 5-10 sekunnin ajan kevyesti ravistamalla alkoholiase- tonissa. Tai aseta arkki pystysuoraan asentoon ja pudota värinpoistoaineen tippoja pinnalle, kunnes ylimääräinen pidättämätön violettilasi on poistettu. Älä ylitä.
6. Pese vedellä Älä kuivaa.
7. Vaihda värisillan kalvo ja peitä 30 sekuntia safraniinilla (Gram-Hucker) tai 1 minuutin ajan emäksisellä fuksiinilla (Gram-Kopeloff).
8. Pese vedellä
9. Anna sen kuivua itsestään pystyasennossa.

Kun kuiva on, aseta 1 tippa upotusöljyä tarkkaillaksesi sitä 100X-objektiivin alla valomikroskoopissa.

Apuohjelma

Tämän tekniikan avulla voidaan erottaa useimpien bakteerien morfotintoriaaliset erot.

Hiivat erottuvat myös tällä värityksellä. He ottavat kristallivioletin, eli värjäävät gram-positiivisina.

Toisaalta voidaan erottaa itiöitä muodostavat grampositiiviset sauvat, joissa selkeä tila havaitaan bacilluksen sisällä, missä endospoori muodostui, vaikka itiöt eivät värjää hyvin. Muita tekniikoita, kuten Shaeffer-Fulton, käytetään itiöiden värjäämiseen.

On huomattava, että tätä värjäystä ei käytetä kaiken tyyppisten bakteerien värjäämiseen, ts. On tapauksia, joissa värjäys ei toimi.

Tässä tapauksessa voidaan mainita bakteerit, joilla ei ole soluseinää. Esimerkiksi: Mycoplasma-suku, sferoplastit, ureaplasma, L-muodot ja protoplastit.

Se värjää myös erittäin huonosti bakteereja seinillä, joissa on runsaasti mykolihappoja, kuten mycobacteria, ja solunsisäisiä bakteereja, kuten Chlamydias ja Rickettsias.

Se on tehoton myös useimpien spirochetal-bakteerien värjäämisessä.

On saman suvun bakteereja, jotka voidaan havaita samassa näytteessä kuin gram-positiivisia ja gram-negatiivisia. Kun tämä tapahtuu, sitä kutsutaan muuttuvaksi gram-värjäytykseksi, joka voi johtua ravintoaineiden, lämpötilan, pH: n tai elektrolyyttipitoisuuden muutoksista.

Yleiset virheet

Liiallinen valkaisu

Värjäytymisvaiheen liioittelu voi johtaa väärien gramnegatiivisten mikro-organismien havaitsemiseen.

Odottamatta tarpeeksi kauan kuivumisaikaa upotusöljyn lisäämiseksi

Se voi aiheuttaa gram-positiivisia bakteereja värjäämään gram-negatiivisia (väärät gram-negatiiviset). Tämä tapahtuu, koska vanhoissa viljelmissä on todennäköisesti kuolleita tai pilaantuneita bakteereja, ja näissä olosuhteissa bakteerit eivät pidä kideviolettia.

Käytä hyvin vanhaa lugol-ratkaisua:

Ajan myötä lugol menettää ominaisuutensa ja sen väri haalistuu. Jos jo jo degeneroitua reagenssia käytetään, se ei kiinnitä kristalliviolettia hyvin, siksi on mahdollista saada visualisointi väärin gram-negatiivisista mikro-organismeista.

Sininen tausta

Oikein värjätty tausta on punainen. Sininen tausta osoittaa, että väri ei ollut riittävä.

Viitteet

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Lääketieteellinen mikrobiologia, 6. painos McGraw-Hill, New York, USA
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. (5. painos). Argentiina, Toimitus Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott: n mikrobiologinen diagnoosi. 12 toim. Argentiina. Toimituksellinen Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Yleinen mykologia. 2. toim., Venezuelan keskusyliopisto, Library Editions. Venezuela Caracas.
5. "Gram tahra." Wikipedia, ilmainen tietosanakirja. 4. lokakuuta 2018, 23:40 UTC. 9. joulukuuta 2018, 17:11. Otettu es.wikipedia.org-sivulta.
6. González M, González N. 2011. Lääketieteellisen mikrobiologian opas. 2. painos, Venezuela: Carabobon yliopiston tiedotusvälineiden ja julkaisujen osasto.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Perusmaalit mikrobiologisessa laboratoriossa. Vammaisuustutkimus. 2014; 3 (1): 10-18.