REKOMBINANTTI-DNA: TEKNIIKKA, SOVELLUKSET JA PERUSTEET - BIOLOGIA - 2026

Rekombinantti-DNA (rDNA tai rDNA) on keinotekoinen nukleiinihappomolekyyli luotu laboratoriossa, yhdistämällä kaksi segmenttiä kiinnostavia organisaatioiden. Se tunnetaan myös kimeerisenä DNA: na hybridiominaisuutensa ansiosta. Tämän tyyppistä DNA: ta ei löydy luonnosta.

Perusmenetelmä sen tuottamiseksi sisältää: (a) kohde-DNA: n valinnan ja sen insertion toiseen DNA-fragmenttiin (yleensä bakteeriplasmidiin); (b) tämän plasmidin vieminen bakteeriin, (c) bakteerien valinta antibioottien avulla ja lopulta (d) geenin ilmentyminen.

Lähde: pixabay.com

Tekniikassa hyödynnetään joukko entsyymejä, jotka tekevät mahdolliseksi kopioida ja liittää tiettyjä DNA-fragmentteja tutkijan arvion mukaan.

Yhdistelmätekniikan tavoitteena on useimmissa tapauksissa proteiinin (tunnetaan yhdistelmäproteiinina) ekspressio, jota molekyylibiologi haluaa tulevaisuuden tutkimusta varten tai kaupallisen ja terapeuttisen arvon omaavan proteiinin luomiseksi - kuten ihmisinsuliini, esimerkiksi.

Rekombinantti-DNA-tekniikan perusteet ja sen käyttö geenitekniikassa

Molekyylibiologian keskeinen dogma

Kaikilla tunnetuilla orgaanisilla olennoilla on useita ominaisuuksia. Yksi niistä on geneettisen materiaalin luonne ja tapa, jolla proteiineja valmistetaan - prosessi, jota kutsutaan molekyylibiologian keskeiseksi ”dogmaksi”.

Paria viruksia lukuun ottamatta kaikki organismit tallentavat geneettistä tietoa DNA: han (deoksiribonukleiinihappo), joka kerätään erittäin kompaktein ja organisoidusti solun ytimeen.

Geeniekspressiota varten DNA-molekyyli transkriptoidaan lähetti-RNA: ksi, ja viimeksi mainittu käännetään aminohappojen kielelle, joka on proteiinien rakennuspalikoita.

Mikä on rekombinantti-DNA?

1970-80-luvuilla molekyylibiologit alkoivat hyödyntää prosesseja, joita luonnollisesti tapahtuu solun sisällä, ja pystyivät ekstrapoloimaan ne laboratorioon.

Tällä tavalla eläinperäinen geeni (esimerkiksi selkärankainen) voitaisiin insertoida bakteerin DNA-segmenttiin; tai bakteerin DNA voitaisiin yhdistää virus-DNA: han. Siksi voimme määritellä rekombinantti-DNA: n molekyylinä, joka koostuu kahden eri organismin DNA: sta.

Kun tämä hybridi tai rekombinantti molekyyli on luotu, mielenkiinnon kohteena oleva geeni ilmenee. Sanalausekkeella tarkoitamme proteiinimuunnoksen prosessia.

Restriktioentsyymit ja ligaasit: avain prosessiin

Avaintekijä rekombinantti-DNA-tekniikan kehittämisessä oli restriktioentsyymien löytäminen.

Nämä ovat proteiinimolekyylejä, joilla on kyky pilkkoa DNA (nukleaasit) spesifisiksi sekvensseiksi ja jotka toimivat ”molekyylisaksina”. Näiden entsyymien tuottamia fragmentteja kutsutaan restriktiofragmentteiksi.

Mainitut entsyymit voivat tuottaa symmetrisiä leikkauksia kohdesekvenssissä (molemmissa ketjuissa samalla korkeudella) tai epäsymmetrisiä leikkauksia. Keskeinen osa restriktioentsyymien vaikutusta on, että ketjujen katkaisun jälkeen saadaan "löysä reuna", joka on komplementaarinen saman entsyymin leikkaaman toisen reunan kanssa.

Joitakin esimerkkejä ovat ECOR 1 ja Sma 1. Tällä hetkellä tunnetaan yli 200 restriktioentsyymityyppiä ja kaupallisesti saatavissa.

Jotta sakset olisivat käyttökelpoisia, niiden tulee olla liiman mukana. Tämä DNA: n (aikaisemmin käsitelty restriktioentsyymeillä) sulkeva vaikutus suoritetaan ligaasilla.

Tekniikka: kuinka organismin DNA: ta muokataan keinotekoisesti laboratoriossa?

Seuraavassa kuvaamme tärkeimmät vaiheet, joita rekombinantti-DNA-tekniikka vaatii. Kaikki suorittavat ammattilaiset molekyylibiologian laboratoriossa.

Mikä on "klooni"?

Ennen kuin jatkat kokeellista protokollaa, meidän on huomattava, että molekyylibiologiassa ja bioteknologiassa termiä "klooni" ja verbi "klooni" käytetään laajasti. Tämä voi johtaa sekaannukseen.

Tässä yhteydessä emme viittaa kokonaisen organismin kloonaamiseen (kuten esimerkiksi kuuluisan Dolly-lampaan tapauksessa), vaan DNA-kappaleen, joka voi olla geeni, kloonaukseen. Eli tuottaa useita sekvenssin - geneettisesti identtisiä - kopioita.

1. DNA: n eristäminen ja saaminen

Ensimmäinen askel on päättää, mitä sekvenssiä haluat käyttää. Tämä riippuu täysin tutkijasta ja hänen työnsä tavoitteista. Tämä DNA on sitten eristettävä ja puhdistettava. Menetelmät ja menetelmät tämän saavuttamiseksi riippuvat puolestaan ​​kehosta ja kudoksesta.

Yleensä otetaan kudospala ja käsitellään hajotuspuskurissa proteinaasi K: lla (proteolyyttinen entsyymi) ja sitten DNA uutetaan. Myöhemmin geenimateriaali hajotetaan pieniksi fragmenteiksi.

2. Kloonausvektori

Valmistelutoimien jälkeen tutkija pyrkii viemään kiinnostavan DNA-segmentin kloonausvektoriin. Tästä lähtien kutsumme tätä DNA-segmenttiä valkoiseksi DNA: ksi.

plasmidit

Yksi eniten käytetyistä vektoreista bakteerista peräisin olevassa plasmidissa. Plasmidi on kaksijuosteinen, pyöreä DNA-molekyyli, jota löytyy luonnostaan ​​bakteereista. Ne ovat vieraita bakteerikromosomille - ts. Ne ovat kromosomaalisia ja niitä esiintyy luonnollisesti näissä prokaryooteissa.

Vektorin peruselementit ovat: (a) replikaation aloituskohta, joka mahdollistaa DNA: n synteesin; (b) selektioaine, joka tekee mahdolliseksi identifioida organismit, jotka kantavat plasmidia kohde-DNA: lla, kuten resistenssi joillekin antibiooteille; ja (c) monikloonauskohta, jossa löydetään sekvenssit, jotka restriktioentsyymit tunnistavat.

Laboratorion ensimmäinen onnistunut rekombinantti-DNA kloonattiin plasmidiin pSC101 bakteerista E. coli. Tämä sisältää restriktioentsyymin EcoRI restriktiokohdan ja geenin resistenssille antibiootille replikaation aloituskohdan lisäksi.

Kohde-DNA: n insertointi plasmidiin suoritetaan käyttämällä edellisessä osassa kuvattuja restriktioentsyymien ja ligaasien molekyylityökaluja.

Jäljellä olevat vektorityypit

Plasmidien lisäksi DNA voidaan insertoida muihin vektoreihin, kuten bakteriofagi lambda, kosmideihin, YAC: iin (hiivan keinotekoiset kromosomit), BAC: iin (bakteerien keinotekoiset kromosomit) ja phagemideihin.

3. Rekombinantti-DNA: n lisääminen

Kun rekombinantti-DNA-molekyyli (mielenkiinnon kohteena oleva geeni plasmidissa tai muussa vektorissa) on saatu, se viedään isäntään tai isäntäorganismiin, joka voi olla bakteeri.

Vieraan DNA: n viemiseksi bakteereihin käytetään tekniikkaa, jota kutsutaan bakteerimuunnokseksi, jossa organismi altistetaan hoidolle kaksiarvoisilla kationeilla, mikä tekee siitä herkän DNA: n ottamiselle.

Metodologisesti emme voi taata, että 100% viljelmämme bakteereista on ottanut tehokkaasti rekombinantti-DNA-molekyylimme. Tällöin tulee osa plasmidista, joka sisältää antibioottiresistenssin.

Siten bakteerit, jotka ovat ottaneet plasmidin, ovat resistenttejä tietylle antibiootille. Niiden valitsemiseksi riittää, että levitetään mainittu antibiootti ja otetaan eloonjääneet.

4. "Sadonkorjuu" proteiini

Kun bakteerit on valittu yhdistelmä-DNA: llamme, jatkamme isäntä-entsymaattisten koneiden käyttöä kiinnostavan proteiinituotteen tuottamiseksi. Kun bakteerit lisääntyvät, plasmidi välittyy heidän jälkeläisilleen, joten se ei häviä jakautumisen aikana.

Tämä menetelmä käyttää bakteereja eräänlaisena proteiinin "tehtaana". Myöhemmin näemme, että se on ollut erittäin merkityksellinen menetelmä tehokkaiden lääkehoitojen kehittämisessä.

Kun viljelmä on valmis ja bakteerit ovat tuottaneet suuria määriä proteiinia, solu hajottaa tai hajottaa. On olemassa laaja valikoima biokemiallisia tekniikoita, jotka mahdollistavat proteiinien puhdistamisen niiden fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien mukaan.

Toisessa kokeellisessa kontekstissa emme ehkä ole kiinnostuneita proteiinin tuottamisesta, vaan olemme kiinnostuneita saamaan DNA-sekvenssin sinänsä. Jos näin olisi, plasmidia käytettäisiin luomaan useita kopioita kiinnostavasta fragmentista, jotta kohde-DNA: lla olisi tarpeeksi merkityksellisten kokeiden suorittamiseksi.

Sovellukset

Rekombinantti-DNA-tekniikka avasi äärettömän määrän mahdollisuuksia molekyylibiologian, biotekniikan, lääketieteen ja muilla siihen liittyvillä aloilla. Sen merkittävimmät sovellukset ovat seuraavat.

Geneettinen analyysi

Ensimmäinen sovellus liittyy suoraan molekyylibiologian laboratorioihin. Rekombinantti-DNA-tekniikka antaa tutkijoille mahdollisuuden ymmärtää geenien normaali toiminta ja tuotettuja proteiineja voidaan käyttää jatkotutkimuksissa.

Lääketeollisuus

Rekombinantti-DNA-menetelmää käyttämällä tuotetut proteiinit ovat sovelluksia lääketieteessä. Kaksi erittäin merkityksellistä esimerkkiä kentällä ovat ihmisinsuliini ja kasvuhormoni, joita käytetään potilailla, joilla ei ole tätä proteiinia.

Rekombinantti-DNA: n ansiosta näitä proteiineja voidaan tuottaa ilman tarvetta erottaa niitä toiselta ihmiseltä, mikä merkitsee lisämenetelmiä ja terveysriskejä. Tämä on auttanut parantamaan lukemattomien potilaiden elämänlaatua.

Viitteet

1. Baca, LEL ja Álvarez, CLC (2015). Biologia 2. Grupo Toimituksellinen Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE, ja Hausman, RE (2000). Solu: molekyylimenetelmä (osa 10). Washington, DC: ASM-lehdistö.
3. Devlin, TM (2004). Biokemia: kliinisiin sovelluksiin liittyvä oppikirja. Käänsin.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Rekombinantti-DNA-tekniikan rooli elämän parantamisessa. Kansainvälinen genomiikan lehti, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, ja Mindan, P. (1996). Patologinen anatomia. Elsevier Espanja.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). Johdatus mikrobiologiaan. Panamerican Medical Ed.
7. The, MJ (1989). Ihmisinsuliini: DNA-tekniikan ensimmäinen lääke. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.