SIMMONS CITRATE AGAR: PERUSTELUT, VALMISTELU JA KÄYTTÖ - BIOLOGIA - 2026

Agar Simmons sitraatti se on kiinteä alusta käytetään biokemiallisia tunnistamistesti mikro-organismien, erityisesti gram - negatiivinen basilleja. Alkuperäisen välineen loi Koser vuonna 1923.

Koser-sitraattiväliaine koostui liemestä, joka sisälsi natriumfosfaattia, ammoniumfosfaattia, monokaliumfosfaattia, magnesiumsulfaattia ja natriumsitraattia.

A. Kuivatut Simmons-sitraatti-agar-kaupallinen väliaine B. Valmistetut Simmons-sitraattiagar. Lähde: A. Kuvan ottanut MSc. Marielsa Gil B. Roto2esdios, Wikimedia Commonsista

Kuten voidaan nähdä, väliaineen ainoa hiilen lähde on sitraatti, ja typpi on ammoniumfosfaatti, jättämättä proteiineja ja hiilihydraatteja näiden alkuaineiden lähteeksi, niitä on yleensä läsnä muissa väliaineissa.

Siksi tähän väliaineeseen inokuloidut bakteerit voivat lisääntyä vain, jos ne kykenevät ottamaan hiilen sitraatista. Testi oli positiivinen, jos väliaineessa oli sameutta, mutta sen haittana oli, että epäspesifistä sameutta voi esiintyä.

Simmons ratkaisi tämän ongelman lisäämällä bromitymolisinistä ja agaria Koserin alkuperäiseen kaavaan. Vaikka periaate on sama, sitä tulkitaan eri tavalla.

Perusta

Joillakin bakteereilla on kyky selviytyä ilman käymistä tai maitohapon tuotantoa, ja niiden on saatava energiaa muiden substraattien avulla. Tässä testissä ainoa tarjottava hiililähde on sitraatti.

Bakteerit, jotka kykenevät selviämään näissä olosuhteissa, metaboloivat sitraatin nopeasti vaihtoehtona perinteiselle reitille käyttämällä trikarboksyylihapposykliä tai sitraattifermentaatiosykliä.

Bakteerien aiheuttama sitraatin katabolismi käsittää entsymaattisen mekanismin ilman koentsyymi A: n puuttumista siihen. Tämä entsyymi tunnetaan nimellä sitricase (sitrate oxaloacetate lyase) tai citrate desmolase. Reaktio vaatii kahdenarvoisen kationin läsnäolon, jota silloin toimittaa magnesium.

Reaktio tuottaa oksaloasetaattia ja pyruvaattia, jotka sitten muodostavat orgaanisia happoja keskellä alkalista pH: ta, joka muodostuu typpilähteen käytöstä. Näitä orgaanisia happoja käytetään hiililähteenä, joka tuottaa karbonaatteja ja bikarbonaatteja, alkaloiden edelleen ympäristöä.

Kylvotila

Simmonsin sitraattiväliaine tulisi inokuloida kevyesti kalanpäähän suoraa silmukkaa tai neulaa käyttämällä ja inkuboida 24 tuntia 35-37 ° C: ssa. Ajan kuluttua tulokset havaitaan.

Kylvö tapahtuu vain agarin pinnalla. Älä lävistä.

Tulkinta

Jos väliaine pysyy alkuperäisenä värinä (vihreä) eikä näkyvää kasvua ole, testi on negatiivinen, mutta jos väliaine muuttuu siniseksi, se osoittaa alkalisten tuotteiden läsnäolon, joka havaitaan pH-indikaattorilla. Tässä tapauksessa testi on positiivinen.

Sitraatti (+) ja (-). Lähde: MSc. Marielsa gil

Näin tapahtuu, koska jos bakteeri käyttää sitraatin hiiltä, ​​se kykenee myös ottamaan typpeä ammoniumfosfaatista, jonka kanssa se vapauttaa ammoniakkia, alkaloimalla väliainetta.

Toisaalta, jos bakteerien kasvua havaitaan väliaineessa, mutta värimuutoksia ei tapahdu, testiä on myös pidettävä positiivisena, koska jos kasvua tapahtuu, se tarkoittaa, että bakteerit pystyivät käyttämään sitraattia hiilen lähteenä, vaikka pH: ssa ei ole muutosta tällä hetkellä (joskus se voi viedä aikaa).

Jos lopullisen värin tulkinnassa on epäilyksiä, sitä voidaan verrata ei-rokotettuun sitraattiputkeen.

Valmistautuminen

Punnitaan 24,2 g kuivattua väliainetta litraa vettä. Sekoita ja anna sen levätä noin 5 minuuttia. Lopeta väliaineen liukeneminen kuumentamalla yksi tai kaksi minuuttia ravistaen usein.

Kaada 4 ml koeputkiin ja autoklaavi 121 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Autoklaavista poistuttaessa kallista tuen avulla siten, että agar jähmettyy huilun nokan muodossa, jossa on vähän lohkoa tai pohjaa ja enemmän viistetty.

Sitraattiväliaineen lopullinen pH on 6,9 (vihreä väri). Tämä väliaine on erittäin herkkä pH: n muutoksille.

PH 6: ssa tai sitä alhaisemmassa lämpötilassa väliaine muuttuu keltaiseksi. Tätä väriä ei havaita bakteeritestissä.

Ja pH: ssa 7,6 tai yli, väliaine muuttuu syväksi Preussin siniseksi.

Käyttää

Simmons-sitraattiagaria käytetään tiettyjen mikro-organismien, etenkin Enterobacteriaceae-perheeseen kuuluvien bakteerien, ja muiden kuin glukoosia fermentoivien bakteerien tunnistamiseen.

Lähde: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5. toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.

Lopulliset ajatukset

Simmonsin sitraattiväliaine on erittäin herkkä testi, koska vääriä positiivisia voidaan saada, jos tiettyjä virheitä tehdään.

Seuraavat toimenpiteet on tehtävä:

inokulaatin

Hyvin paksua tai kuormitettua bakteeri-inokulaattia ei pidä tehdä, koska se voi aiheuttaa koppeankeltaisen värin kehittymisen kylvöpaikassa vaikuttamatta muuhun väliaineeseen, mutta se voi johtaa siihen, että uskotaan kasvun olevan. Se ei tarkoita testin positiivisuutta.

Paksu inokulaatti voi myös tuottaa väärän positiivisen, koska kuolleiden bakteerien soluseinämiin muodostetut orgaaniset yhdisteet voivat vapauttaa tarpeeksi hiiltä ja typpeä pH-indikaattorin kääntämiseksi.

Siksi on ihanteellista kylvää käyttämällä neulaa platinakahvan sijasta, jotta vältetään ylimääräisen materiaalin otto.

kylvetty

Toisaalta, kun kyseessä olevan mikro-organismin tunnistamista varten tarkoitettujen biokemiallisten testien paristo siementetään, on tärkeää, että sitraattitesti siirretään ensimmäisenä, jotta vältetään proteiinien tai hiilihydraattien siirtyminen toisesta väliaineesta.

Tässä tilanteessa on mahdollista saada väärät positiiviset, koska kaikki nämä vahingossa johdetut aineet metaboloituvat ja aiheuttavat muutoksen pH: ssa.

Toinen tapa välttää aineiden siirtymistä on polttaa silmukka hyvin ja ottaa uusi siirros testin välillä.

Inokulaation suorittamiseksi on myös oltava varovainen koskettaessaan pesäkettä, koska yllä selitetyn vuoksi tulisi välttää vetämästä osaa agaria viljelmästä, josta bakteerit ovat lähtöisin.

Tässä mielessä Matsen, Sherris ja Branson suosittelevat siirrosteen laimentamista fysiologiseen liuokseen ennen sitraattikokeen siirrostamista muiden hiililähteiden siirtymisen välttämiseksi.

Värin voimakkuus

On otettava huomioon, että testin positiivisen värin voimakkuus voi vaihdella kauppakeskuksen mukaan.

Lisäksi on olemassa mikro-organismeja, joiden testi on positiivinen 24 tunnissa, mutta on myös muita kantoja, jotka vaativat 48 tuntia tai enemmän pH: n muutoksen aikaansaamiseksi.

Viitteet

1. Mac Faddin J. (2003). Biokemialliset testit kliinisesti tärkeiden bakteerien tunnistamiseksi. 3. toim. Toimituksellinen Panamericana. Buenos Aires. Argentiina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott: n mikrobiologinen diagnoosi. 12 toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5. toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
4. BD Laboratories. BBL Simmons sitraattiagar sllants. 2015.Saatavilla osoitteessa: bd.com
5. Britannia Laboratories. Simmons sitraattiagar. 2015.Saatavilla osoitteessa: britanialab.com
6. Valtek Diagnostic Laboratories. Simmons sitraattiagar. 2016.Saatavilla osoitteessa: andinamedica.com.