VAKIO-AGARHELMI: PERUSTELUT, VALMISTELU JA KÄYTTÖ - BIOLOGIA - 2025

Standardi määrä agar on kiinteä, ei-selektiivisessä viljelyväliaineessa, joka on suunniteltu kvantifiointi aerobinen mikrobinen kuormitus näytteessä läsnä olevan juomaveden, jäteveden, maitotuotteet juomat, muun muassa elintarvikkeet. Tätä väliainetta kutsutaan myös PCA-agariksi lyhenteestä englanninkielisessä Plate Count Agar -lehdessä. Sen perustivat vuonna 1953 Buchbinder, Baris ja Goldstein.

Tavanomainen laskettu agar-väliaine koostuu hiivauutteesta, tripteinistä, glukoosista, agarista ja tislatusta vedestä. Tämä formulaatio sisältää perusravinne-elementtejä, jotka mahdollistavat nykyisen aerobisen mikrobikuormituksen kehittymisen, eivätkä vaativat.

Desimaaliset laimennokset CFU: ien laskemiseksi vakio-agar-laskelmissa. Lähde: Quentin Geissmann

Koska väliaine ei sisällä inhibiittoreita, bakteerit voivat kasvaa ilman rajoituksia, mikä tekee siitä ihanteellisen pesäkkeiden yleiseen laskemiseen. Levyjen kvantifiointitekniikka ei kuitenkaan havaitse kaikkia läsnä olevia bakteereita, vaan vain niitä, jotka kykenevät kasvamaan ympäristöolosuhteissa, joille kylvetään vakiolaskuriagar.

Tässä mielessä levyn kvantifiointitekniikalla pyritään yleensä määrittämään aerobista mesofiilistä tyyppiä olevien bakteerien määrä, ts. Ne, jotka kehittyvät lämpötiloissa 25 - 40 ° C, optimaalisen kasvulämpötilan ollessa 37 ° C..

Tämä bakteeriryhmä on erittäin tärkeä, koska suurin osa ihmisen patogeenisistä bakteereista löytyy sieltä.

On huomattava, että joskus voi olla mielenkiintoista määrittää elintarvikkeissa olevien psyrofiilisten bakteerien määrä. Nämä bakteerit kasvavat matalassa lämpötilassa (<20 ° C) ja aiheuttavat ruoan hajoamisen nopeammin, jopa jääkaapissa.

Samoin termofiiliset bakteerit, jotka kehittyvät alueella 50 ° C - 80 ° C tai enemmän, voivat olla tärkeitä tietyntyyppisissä elintarvikkeissa, kuten säilykkeissä.

Mikrobien kvantifiointi ilmaistaan ​​pesäkkeitä muodostavissa yksiköissä (CFU) grammaa tai millilitraa näytettä kohti.

Perusta

Tavallinen laskentaväliaine on suunniteltu mahdollistamaan ei-tyydyttävien aerobisten bakteerien onnistunut kasvu, sillä hiivauute, tripteini ja glukoosi tarjoavat tarvittavat ravintoaineet hyvään mikrobikasvuun.

Toisaalta väliaineella on vaalea väri ja läpinäkyvä ulkonäkö, minkä vuoksi se on ihanteellinen syvä kylvömenetelmällä (levyn kaataminen) kehitettyjen pesäkkeiden visualisointiin.

Pesäkkeiden laskeminen Drigalski-lastalla pintamenetelmällä on myös mahdollista.

Kun mikrobikuormitus on korkea, CFD-arvot voidaan laskea tutkittavan näytteen desimaalilaimennoksilla.

On huomattava, että tätä väliainetta suosittelee American Public Health Association (APHA) aerobisten mesofiilien määrää varten.

Valmistautuminen

Punnitaan 23,5 g dehydratoitua väliainetta ja liuotetaan litraan tislattua vettä. Seoksen liukenemiseksi kokonaan seosta tulisi kuumentaa sekoittamalla usein, kunnes se kiehuu. Seuraavat vaiheet riippuvat käytettävästä kylvötekniikasta.

Valurautatekniikkaan

Levitä jakamalla 12-15 ml koeputkiin. Sen jälkeen steriloidaan autoklaavissa 121 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Anna jähmettyä pystysuoraan lohkon muodossa. Säilytä jääkaapissa käyttöön asti.

Sulata pistoke, kun aiot käyttää sitä. Sulamisen jälkeen pidä se vesihauteessa 44-47 ° C: ssa näytteiden valmistuksen ajan.

Pinta-kylvöön

Steriloi väliaine autoklaavissa 121 ° C: ssa ja jaa sitten 20 ml steriileihin Petri-maljoihin. Anna jähmettyä, käännä ylösalaisin ja säilytä jääkaapissa käyttöönottoon asti.

Temperaattorilevyt ennen käyttöä. Elatusaineen pH: n tulisi olla 7,0 ± 0,2.

Käyttää

Vakiolaskuriagaria käytetään aerobisessa mesofiilisessä laskentatekniikassa veden ja ruoan mikrobiologisessa analyysissa. Aerobisten mesofiilien määrä on välttämätön, koska se määrittelee tutkittavan näytteen terveyslaadun.

Tämän tekniikan soveltaminen (tätä väliainetta käyttämällä) mahdollistaa eristettyjen pesäkkeiden makroskooppisen visualisoinnin niiden kvantifiointia varten.

Levyjen kaatamistekniikka (syväsyöttö)

-Prosessi

Tekniikka koostuu seuraavista:

1) Homogenisoidaan näyte läsnä olevien bakteerien jakamiseksi uudelleen.

2) Alkuperäinen suspensio valmistetaan steriiliin pulloon tai pussiin ottaen huomioon 10 g: n tai 10 ml: n näytteen suhde 90 ml: aan laimenninta (10 ^-1).

3) Alkuperäisuspensiosta tehdään asianmukaiset desimaalilaimennokset näytteen tyypistä riippuen. Esimerkki: (^10-2, ^10-3, ^10-4). Laimennukset tehdään peptonivedellä tai fosfaattipuskurilla.

Tätä varten otetaan 1 ml alkuperäistä suspensiota ja asetetaan se 9 ml: aan laimenninta, jatketaan laimennuksia tarvittaessa ottaen nyt 1 ml 10 ^-2- laimennosta ja niin edelleen.

4) Ota 1 ml jokaisesta laimennuksesta ja aseta tyhjiin steriileihin Petri-maljoihin.

5) Lisää jokaiselle levylle 12-15 ml vakiolaskuriagaaria, joka on aiemmin sulanut ja asettunut 44 - 47 ° C: seen.

6) Pyöritä levyjä varovasti, jotta näyte jakautuu tasaisesti agaria pitkin ja antaa sen jähmettyä.

7) Levyt käännetään ja inkuboidaan 37 ° C: ssa aerobioosissa 24 - 48 tuntia.

8) Ajan lopussa levyt tutkitaan ja pesäkkeet lasketaan laimennokseen, joka sen sallii. Laskelmaan valitaan ne levyt, joissa on 30-300 CFU.

Laskenta voidaan tehdä manuaalisesti tai voit käyttää siirtomaalaskurilaitteita.

Näytteen millilitraa kohden sallitut arvot voivat vaihdella maasta toiseen riippuen säännöksistä, joita niitä säädellään.

-UFC: n laskenta

Yleinen laskenta suoritetaan seuraavan kaavan avulla:

Kaava CFU: n määrällisen määrittämisen yleiseksi laskemiseksi. Lähde: Lääke-, elintarvike- ja lääketieteellisen tekniikan kansallinen hallinto (ANMAT). Ruoan mikrobiologinen analyysi, virallinen analyyttinen menetelmä, indikaattorimikro-organismit. 2014 Volume 3. Saatavana osoitteessa: anmat.gov.ar

Tulokset ilmaistaan ​​yhdellä tai kahdella numerolla kerrottuna asianmukaisella emäksellä 10. Esimerkki: jos tulos on 16 545, se pyöristetään kolmannen numeron perusteella arvoon 17 000 ja se ilmaistaan ​​seuraavasti: 1,7 x 10 ⁴. Nyt, jos tulos oli 16436, pyöreä sen 16000 ja ilmaista 1,6 x 10 ⁴.

Pintaviljelytekniikka

-Prosessi

-Sisältää 0,1 ml: aa suoraa näytettä, jos se on nestemäistä, alkususpensio 10 ^-1 tai peräkkäisiä laimennuksia 10 ^-2, 10 ^-3 jne., Vakiolaskurin sisältävän agarlevyn keskellä.

-Jäytä näyte tasaisesti Drigalski-lastalla tai L-muotoisella lasisauvalla ja anna sen levätä 10 minuuttia.

-Käännä levyt ja inkuboi aerobisesti 37 ° C: ssa 24 - 48 tuntia.

-Muutka pesäkkeiden laskemiseksi, valitse levyt, jotka ovat välillä 20 - 250 CFU.

-UFC: n laskenta

Laskentaan käytetään laimennuskerrointa, joka on käänteinen. Luku pyöristetään 2 merkitsevää numeroa (pyöristämällä kolmannen numeron mukaan) ja ilmaistaan ​​kannan 10 tehona. Jos esimerkiksi näytteessä lasketaan 224 CFU: ta ilman laimennusta (10 ^-1), ilmoitetaan 22 x 10 ¹ CFU, mutta jos luku oli 225, 23 x 10 ¹ CFU raportoitu.

Nyt, jos 199 CFU lasketaan 10 ^-3 laimennus, 20 x 10 ⁴ CFU raportoidaan, mutta jos 153 CFU lasketaan samalla laimennus, 15 x 10 ⁴ CFU raportoidaan.

QA

Tavallinen laskennallinen elatusaine voidaan arvioida tunnetuilla sertifioiduilla kannoilla, kuten: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri.

Jos viljelyalusta on optimaalisissa olosuhteissa, tyydyttävää kasvua odotetaan kaikissa tapauksissa paitsi L. fermentumille, jolla voi olla säännöllinen saanto.

Viljelyväliaineen steriiliyden arvioimiseksi yhtä tai kahta levyä jokaisesta valmistetusta erästä (ilman rokotusta) tulisi inkuboida 37 ° C: ssa aerobioosissa 24 tunnin ajan. Tämän ajan kuluttua kasvualustassa ei tulisi havaita kasvua tai värin muutosta.

rajoitukset

- Älä sulaa agaria useammin kuin kerran.

- Valmistettu väliaine voi kestää jopa 3 kuukautta, kunhan sitä pidetään jääkaapissa ja suojassa valolta.

-Tämä väliaine ei sovellu vaativiin tai anaerobisiin mikro-organismeihin.

Viitteet

1. Kansallinen lääke-, elintarvike- ja lääketieteellisen tekniikan hallinto (ANMAT). Ruoan mikrobiologinen analyysi, virallinen analyyttinen menetelmä, indikaattorimikro-organismit. 2014 Volume 3. Saatavana osoitteessa: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Lautaslaskelmagar. 2009.Saatavilla osoitteessa:
3. Conda Pronadisa Laboratories. APHA: n ja ISO 4833: n mukainen standardimenetelmä-agar (PCA). Saatavana osoitteessa: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Agar-levyn lukumäärä. 2015.Saatavilla osoitteessa: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B ja Velázquez O. 2009. Elintarvikkeiden mikrobiologisen analyysin tekniikat. 2. toim. Kemian tiedekunta, UNAM. Meksiko. Saatavana osoitteessa: depa.fquim.unam