Agar Endo tai Endo väliaine on kiinteä alusta, ero ja jonkinasteista selektiivisyyttä kulttuurin. Alkuperäinen kaava luotiin Endon vuonna 1904 erottamiseksi laktoosikäynnistä ei-käymisbakteereista. Alun perin se oli suunniteltu Salmonella typhin eristämiseen, mutta myöhemmin kasvualustan tavoite kääntyi koliformien etsimiseen.
Endo-agarin periaate on säilynyt, mutta sen muotoilu on muuttunut vuosien mittaan lukemattomiin muutoksiin. Tällä hetkellä väliaine koostuu eläinkudoksen peptidigeelistä, laktoosista, dikaliumvetyfosfaatista, natriumsulfiitista, emäksisestä fuksiinista ja agarista.
A: Neitsyt endo-agar B: Siemennetty endo agari, agarin keskellä voit huomata E. coli -kannan metallisen kiillon. Lähde: A: Strolch1983 / B: LenkaM
Elatusaineen pääasiallinen käyttö on liitetty Enterobacteriaceae-perheeseen ja muihin läheisiin perheisiin kuuluvien gramnegatiivisten bakteerien eristämiseen ja erilaistumiseen.
Sitä käytettiin pitkään koliformaamien havaitsemiseen vesi-, meijeri- ja ruuanäytteissä, mutta muut välittäjät, joilla on samankaltaiset toiminnot, ovat tämän väliaineen syrjäyttäneet nykyään. Jotkut mikrobiologialaboratoriot kuitenkin käyttävät tätä agaria enterobakteerien eristämiseen kliinisen alkuperän näytteistä.
Perusta
Endo-agar sisältää peptoneja, jotka toimivat aminohappojen, typen, hiilen ja energian lähteenä, jotka ovat tarpeettomia tarpeettomien mikro-organismien kasvulle.
Toisaalta agarin lievästi selektiivinen luonne saadaan lisäämällä natriumsulfiittia ja emäksistä fuksiinia; molemmat komponentit estävät osittain tai kokonaan useimpien gram-positiivisten bakteerien kasvua.
Erotusluonteen antaa käymissa olevan hiilihydraatin läsnäolo, joka tässä tapauksessa on laktoosi ja emäksinen fuksiini, joka toimii myös pH-indikaattorina.
Gramnegatiiviset bakteerit, jotka kasvavat tällä agarilla ja kykenevät fermentoimaan laktoosia, muodostavat vahvoja vaaleanpunaisia pesäkkeitä; Koska Escherichia coli on patognomoninen, tummanpunaisten pesäkkeiden muodostuminen irisoivalla vihertävällä metallisella kiillolla. Tämä johtuu happojen korkeasta tuotannosta hiilihydraatti käymisessä.
On huomattava, että pesäkkeiden ympärillä oleva väliaine muuttuu myös voimakkaana vaaleanpunaisena. Gramnegatiiviset sauvat, jotka eivät sisällä laktoosia, muodostavat vaalean vaaleanpunaisia pesäkkeitä, jotka ovat samanlaisia kuin keskipitkä tai väritön.
Dikaliumvetyfosfaatti tasapainottaa kasvualustan pH: ta ja agar on komponentti, joka tarjoaa kiinteän konsistenssin.
Valmistautuminen
Endo-agar
Punnitaan 41,5 g kuivattua väliainetta ja liuotetaan 1 litraan tislattua vettä. Kuumenna seosta usein sekoittaen, kunnes väliaine on liuennut täydellisesti. Steriloidaan autoklaavissa 121 ° C: n lämpötilassa, 15 naulan paineessa 15 minuutin ajan.
Kun poistat autoklaavista, anna jäähtyä noin 45-50 ° C: n lämpötilaan, ravista seosta homogenoimaan ennen tarjoilua. Kaada 20 ml steriileihin Petri-maljoihin.
Anna levyjen jähmettyä, kääntyä ylöspäin ja varastoida plaquero-osaan tai kääriä tummalle paperille ennen varastointia jääkaapissa. On erittäin tärkeää suojata valmistettu väliaine suoralta valolta. Paras tapa on valmistaa tarkka määrä, jota tarvitset.
Jos levyjä säilytetään jääkaapissa, niiden tulisi antaa lämmetä ennen käyttöä.
Alustan pH: n tulisi olla välillä 7,2-7,6, ja valmistetun väliaineen väri on vaaleanpunainen.
M-Endo-agarvariantti
Endo-agarista (m-Endo) on toinen versio, joka seuraa McCarthy, Delaney ja Grasso kaavaa, joka sisältää enemmän yhdisteitä ja vaihtelee valmistusmuodossa.
Tämä variantti sisältää: laktoosia, tryptoosia, kaseiinin entsymaattisia sulatuksia, eläinkudoksen entsymaattisia sulatuksia, natriumkloridia, kaksiemäksistä kaliumfosfaattia, natriumsulfiittia, hiivauutetta, yksiemäksistä kaliumfosfaattia, emäksistä fuksiinia, natriumdeoksikolaattia, lauryylisulfaattia natrium ja agar.
Tässä tapauksessa punnitaan 51 g dehydratoitua väliainetta ja suspendoidaan 1 litraan tislattua vettä, joka sisältää 20 ml etanolia.
Kuumenna hieman sekoittaen, kunnes väliaine liukenee kokonaan. Sitä ei tule ylikuumentaa eikä autoklaavoida. Kun seos on homogeeninen, tarjoile steriileissä Petri-maljoissa ja anna jähmettyä.
Käyttää
Joissakin maissa sitä käytetään edelleen laskemaan kokonais- ja fekaaliset kolibakteerit bakteerien muodostumisesta ruoka- ja vesinäytteissä, etenkin Escherichia colin esiintyessä fekaalikontaminaation pääindikaattorina.
American Public Health Association (APHA) suosittelee M-Endo-agaria desinfiointi- ja jätevedenkäsittelyohjelmien seurantaan ja valvontaan sekä juomaveden laadun arviointiin.
Yleisimmin käytetty menetelmä on kalvosuodatus sen jälkeen, kun näytettä on rikastutettu Lauryylisulfaattiliemellä 2 - 4 tuntia.
Sitä voidaan käyttää myös EMB-agarin korvikkeena ruoan ja veden mikrobiologisessa analyysissä todennäköisimmällä lukumekniikalla (MPN), erityisesti täydellisessä vahvistusvaiheessa, jotta voidaan vahvistaa E. colin esiintyminen pilvistä EC-liemeistä.
QA
Tunnetut tai sertifioidut kontrollikannat kylvetään valmistetun Endo-agar-erän laadun arvioimiseksi.
Kannoista, joita voidaan käyttää tähän tarkoitukseen, ovat: Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 11775, Enterobacter cloacae ATCC 13047, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Shigella flexneri ATCC 1400 ja EnterCluso 14CC14002..
Kannat ympätään loppuun ja niitä inkuboidaan 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan aerobioosissa.
Odotetut tulokset ovat:
- Escherichia coli: vahvat punaiset pesäkkeet, joissa metallinen kiilto.
- E. cloacae- ja K. pneumoniae -bakteerien pesäkkeiden tulisi olla vaaleanpunaisia mucoideja.
- S. typhimuriumin, S. flexnerin ja P. mirabilisin tapauksessa pesäkkeet ovat yleensä vaaleanpunaisia tai värittömiä.
- Lopuksi, E. faecalis -bakteerin odotetaan estävän osittain, siksi sen kasvun on oltava heikkoa hyvin pienillä, vahvoilla vaaleanpunaisilla pesäkkeillä.
rajoitukset
-Endo-elatusaineella on heikko selektiivinen teho, siksi on mahdollista, että jotkut gram-positiiviset mikro-organismit, kuten Staphylococcus, Enterococcus ja jopa hiivat, voivat kasvaa.
-Muut bakteerit, jotka eivät kuulu Enterobacteriaceae-perheeseen, voivat kehittyä tässä väliaineessa, kuten Pseudomonas sp ja Aeromonas sp. Näiden kantojen ominaisuudet ovat värittömiä epäsäännöllisiä pesäkkeitä.
-Tämä valmistettu väliaine on erittäin herkkä valolle, joten pitkäaikainen altistuminen sille huonontaa indikaattorijärjestelmää ja vahingoittaa väliainetta peruuttamattomasti.
-Elatusaineen komponentteja pidetään syöpää aiheuttavina, joten suoraa kosketusta tulisi välttää.
- Kuivattu väliaine on erittäin hygroskooppinen ja sitä on pidettävä alkuperäisessä pakkauksessaan huoneenlämmössä, tiiviisti suljettuna ja kuivassa ympäristössä.
Viitteet
- BD Laboratories. Endo agar. 2013.Saatavilla osoitteessa: bd.com
- Neogen Laboratories. M Endo agar. Saatavana osoitteessa: foodsafety.neogen.com
- Endo agar. Wikipedia, ilmainen tietosanakirja. 7. syyskuuta 2017, kello 08:27 UTC. 28. helmikuuta 2019, 22:55. Saatavana: en.wikipedia.
- MercK-laboratorio. Endo-agar. 2019. Saatavissa osoitteessa: merckmillipore.com
- Teknisten lehtien laboratoriot. M –Endo Agar LES. 2015.Saatavilla osoitteessa: liofilchem.net