- Perusta
- Peptonit ja hiivauute
- Glukoosi
- L-lysiini
- PH-indikaattori (bromikresolipunainen)
- Rauta (ammonium) sitraatti ja natriumtiosulfaatti
- Testin tulkinta
- Lysiinin dekarboksylointi
- Lysiinin deaminointi
- Rikkivety (H
- Tulosten kirjaaminen
- Valmistautuminen
- Sovellukset
- Viitteet
Agar LIA (lysiini rauta) on biokemiallinen koe, jota käytetään bakteerien tunnistamiseen Enterobacteriaceae perhe. Tämän välineen ovat luoneet Edwards ja Fife Falkow-kaavan perusteella.
Alun perin tämä testi oli liemi, joka sisälsi peptoneja, hiivauutetta, glukoosia, L-lysiiniä, bromikresolipunaista ja tislattua vettä. Edwards ja Fife lisäsivät agar-agaria, ferri-ammoniumsitraattia ja natriumtiosulfaattia.
Positiivinen ja negatiivinen testi lysiinin dekarboksylaatiolle. Lähde: Tekijän valokuva- ja diagrammiomaisuus MSc. Marielsa gil
Testi koostuu periaatteessa lysiini-dekarboksylaasi-entsyymin läsnäolosta, joka kykenee reagoimaan L-lysiinin aminohapon karboksyyliryhmän kanssa. Aminohapon deaminaatio voi tapahtua myös lysiini-deaminaasi-entsyymin läsnäolon vuoksi.
Lisäksi elatusaineen koostumus osoittaa joidenkin bakteerisukujen kyvyn tuottaa rikkivetyä. Lopuksi on myös mahdollista tarkkailla kaasun muodostumista väliaineessa.
Perusta
Peptonit ja hiivauute
Kuten useimmat viljelyväliaineet, lysiinirauta-agar sisältää komponentteja, jotka tarjoavat ravinteiden lähteen, jota tarvitaan bakteerien kasvuun. Näitä komponentteja edustavat peptonit ja hiivauute.
Glukoosi
Samoin tämä agar sisältää glukoosia fermentoitavana hiilihydraattina. Kaikkien Enterobacteriaceae-perheen bakteerien tiedetään fermentoivan glukoosia.
Tämä vaihe on ratkaisevan tärkeä, koska se vastaa väliaineen happamoittamisesta, mikä on välttämätön edellytys lysiini-dekarboksylaasi-entsyymin - jos läsnä - toimimiseksi sen substraatille.
Joissakin bakteerisukuissa voidaan havaita glukoosin fermentoinnista johtuva kaasuntuotanto.
Kaasu on ilmeistä, kun agarin siirtyminen tapahtuu putkessa, jättäen tyhjä tila putken pohjalle tai hajottamalla väliaine kahteen tai useampaan osaan.
L-lysiini
Kun lysiini on dekarboksyloitunut, muodostuu diamiini (cadaveriini) ja hiilidioksidi.
Dekarboksylaatio tapahtuu koentsyymi-pyridoksaalifosfaatin läsnä ollessa. Tämä reaktio on peruuttamaton.
PH-indikaattori (bromikresolipunainen)
Kaikki pH: n muutokset, jotka esiintyvät väliaineessa erilaisten reaktioiden avulla, havaitaan violetin bromikresolin pH-indikaattorilla.
Tässä mielessä väliaine muuttuu keltaiseksi happamaksi tekemisessä, ja kun alkalisointi tapahtuu, väliaine palaa alkuperäiseen violettiin tai purppuraan väriin.
Kun lysiinin deaminaatio tapahtuu lysiini deaminaasientsyymin läsnäolon vuoksi, pintaan muodostuu punertava väri, joka on tyypillistä sukussa Proteus, Providencia ja joillekin Morganella-lajeille.
Tämä johtuu tosiasiasta, että alfa-ketohiilihappo muodostuu deaminaatioprosessin aikana, joka reagoi ammoniumsitraatin kanssa hapen läsnä ollessa aiheuttaen edellä mainitun värin.
Rauta (ammonium) sitraatti ja natriumtiosulfaatti
Toisaalta, bakteerit, jotka tuottavat vetysulfidia voidaan osoittaa läsnä natriumtiosulfaattia (lähde rikki) ja ferriammoniumsitraattia, joka on kehittäjä H 2 S.
Bakteerit, jotka on entsyymi tiosulfaatti-reduktaasi on kyky toimia vähentämällä natriumtiosulfaatin läsnä, muodostaen sulfiitti- ja rikkivedyn (H 2 S).
Jälkimmäinen on väritön kaasu, mutta kun se reagoi rautasuolan kanssa, muodostuu rautametallisulfidia, joka on liukenematon yhdiste (näkyvä musta sakka).
Kuitenkin, kyky muodostaa H 2 S tällä aineella ei ole kovin luotettava, koska jotkut lysiini dekarboksylaasin negatiivisia bakteereja, jotka kykenevät tuottamaan H 2 S ei muodosta musta sakka, kun happamuus häiritsee. Siksi on suositeltavaa tarkistaa muista rautaa sisältävistä materiaaleista.
Testin tulkinta
Lysiinin dekarboksylointi
Putket tulisi lukea 24 tunnin inkuboinnin jälkeen, muuten on olemassa vaara, että reaktio tulkitaan väärin ja ilmoitetaan vääristä negatiivista.
On muistettava, että ensimmäinen tapahtuva reaktio on glukoosin käyminen, siksi kaikki putket 10 - 12 tunnin kuluttua muuttuvat keltaisiksi.
Jos inkubaatioajan lopussa (24 tuntia) havaitaan keltainen tausta, jonka pinta on violetti tai violetti, reaktio on negatiivinen. Pinnan violetti väri vastaa väliaineen alkalisointia peptoneilla.
Positiivinen reaktio on reaktio, jossa putken pohja ja pinta ovat täysin purppuraisia, ts. Se palaa alkuperäiseen väriin.
Siksi kuka määrittää testin positiivisuuden, on alustan perusta tai tausta. Jos epäilet väriä, sitä voidaan verrata inokuloimattomaan LIA-putkeen.
Lysiinin deaminointi
Lysiinin deaminaatiota osoittavalla putkella on punertava vaaleanpunainen pinta ja keltainen (hapan) tausta tai koko putkessa on punertavanruskea punainen.
Tämä reaktio tulkitaan negatiiviseksi lysiinin dekarboksylaatiolle, mutta positiiviseksi lysiinin deaminaatiolle.
Tämä reaktio määritetään ja tulkitaan kehyksessä.
Rikkivety (H
Positiivinen reaktio havaitaan mustan sakan esiintyessä koko väliaineessa tai osassa sitä. Yleensä viistereunan ja pohjan välissä.
Jos sakkaa esiintyy putken läpi, se ei paljasta muita reaktioita, jotka tapahtuvat keskellä.
Tulosten kirjaaminen
Testiä tulkittaessa tulokset kirjataan seuraavasti:
Ensimmäinen viiste luetaan, sitten pohja tai estää, niin tuotannon H 2 S, ja lopulta kaasun tuotanto.
Esimerkki: K / A + (-). Tämä tarkoittaa:
- K: Alkalinen kehys (violetti väri)
- A: Hapan tausta (keltainen), ts. Negatiivinen dekarboksylointireaktio ja negatiivinen deaminaatio.
- +: Rikkivetytuotanto
- (-): Ilman kaasua.
Valmistautuminen
Punnitaan 35 g kuivattua rauta-agar-lysiiniväliainetta ja liuotetaan se litraan tislattua vettä.
Kuumenna, kunnes agar on täysin liuennut, keitä minuutti sekoittaen usein. Levitä 4 ml väliainetta 13/100-koeputkiin puuvillakorkkeilla.
Steriloidaan autoklaavissa 121 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Poista autoklaavista ja anna seistä kulmassa niin, että siellä on syvä pohja ja lyhyt viiste.
Säilytä jääkaapissa 2-8 ° C. Anna sen lämmetä ennen kylvää bakteerikantaa.
Kuivatun väliaineen väri on beige ja valmistettu väliaine on punertavan violetti.
Valmistetun väliaineen lopullinen pH on 6,7 ± 0,2
Elatusaine muuttuu keltaiseksi pH: ssa 5,2 tai vähemmän ja on violetti pH: ssa 6,5 tai yli.
Sovellukset
Tätä testiä, samoin kuin muita biokemiallisia testejä, käytetään Enterobacteriaceae-perheen bakteerien tunnistamiseen.
Elatusaine siemennetään suoralla silmukalla tai neulalla, putken pohjalle tehdään yksi tai kaksi puhkaisua ja sitten väliaineen pinta tehdään siksak-pisteellä.
Inkuboi 24 tuntia 35-37 ° C: ssa aerobioosissa. Tarvittaessa sitä jätetään inkuboimaan vielä 24 tuntia.
Pääasiassa on hyödyllistä erottaa laktoosinegatiiviset Citrobacter-lajit Salmonellas sp.
Lähde: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5. toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
Viitteet
- Mac Faddin J. (2003). Biokemialliset testit kliinisesti tärkeiden bakteerien tunnistamiseksi. 3. toim. Toimituksellinen Panamericana. Buenos Aires. Argentiina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott: n mikrobiologinen diagnoosi. 12 toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5. toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
- Britannia Laboratories. Lysiinirauta-agar. 2015.Saatavilla osoitteessa: britanialab.com
- BD Laboratories. BBL-lysiini-rauta-agarivirrat. 2007. Saatavana osoitteessa: bd.com
- Valtek Laboratories. Medium LIA 2009. Saatavilla osoitteessa andinamedica.com