MÜELLER HINTON-AGAR: PERUSTA, VALMISTELU JA KÄYTÖT - BIOLOGIA - 2026

Mueller Hinton Agar ei ole valikoiva, kiinteää ravintoalustaa koostuu lihan infuusio, peptoni Happokaseiininäyte tärkkelys, agar ja tislattu vesi. Tämä väliaine mahdollistaa erinomaisen mikrobikasvun useimmille nopeasti kasvaville bakteereille.

Sen ovat alun perin luoneet John Howard Müeller ja Jane Hinton eristääkseen ravitsemukselliset bakteerit, kuten Neisseria gonorrhoeae ja Neisseria meningitidis. Ominaisuuksiensa vuoksi se osoittautui kuitenkin ihanteelliseksi antibioottiherkkyyden tutkimiseksi tarjoamalla luotettavia ja toistettavia tuloksia.

Antibiogrammit (Müeller Hinton-agar). Lähde: Tohtori Graham Beards en.wikipediassa

Siksi Müeller Hinton-agar on elatusaine, jonka ovat hyväksyneet kliininen ja laboratoriostandardi -instituutti (CLSI) ja Euroopan antimikrobien herkkyystestauskomitea, antimikrobisen herkkyystestin suorittamiseksi Kirby-levydiffuusiomenetelmällä ja Bauer.

Perusta

Koska se ei ole selektiivinen ravintoalusta, se on erinomainen useimpien patogeenisten bakteerien kasvuun.

Toisaalta sen yksinkertainen koostumus saa aineet helposti diffundoitumaan siihen, mikä on olennainen ominaisuus herkkyystestille levydiffuusiomenetelmällä.

Toinen sen ominaisuuksista on, että se sisältää pienen määrän inhibiittoreita, mikä sallii sulfonamidien, trimetoprimin ja tetrasykliinien arvioinnin tehokkaasti.

On kuitenkin pidettävä mielessä, että välineen on täytettävä tietyt ehdot, jotta voidaan varmistaa sen asianmukainen toiminta, mukaan lukien:

PH: n säätäminen, agarin syvyys ja sopiva tymiinin, tymidiinin, Ca ^{++: n}, Mg ^{++: n} ja Zn ^{++: n} pitoisuus.

Sinun on myös tiedettävä, että menetelmä on standardisoitu ja siksi kaikkien parametrien on täytyttävä, kuten:

Inokulaattipitoisuus, antibioottilevyjen konsentraatio ja säilyvyys, sopivan lukumäärän levyjen sijoittaminen agarille, levyjen välinen etäisyys, tiettyjen antibioottien strateginen sijoittaminen, ilmakehä, lämpötila ja aika inkuboinnin jälkeen.

Valmistautuminen

Punnitaan 37 g kuivattua Müeller Hinton -väliainetta ja liuotetaan 1 litraan tislattua vettä. Lämmitä väliainetta sekoittaen liukenemisen edistämiseksi. Keitä 1 minuutti.

Autoklaavi steriloitavaksi 121 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Kun irrotat autoklaavista, pullo tulisi asettaa vesihauteeseen 50 ° C: seen jäähtymään. Kaada 25 - 30 ml steriileihin 10 cm: n halkaisijaltaan Petri-maljoihin.

Levyjen tulee olla keskimäärin 4 mm (ihanteellinen), alueen sallittavuus 3-5 mm.

Jos halutaan valmistaa veriagaria käyttämällä Müeller Hinton-agaria emäksenä, kaada 5% steriiliä ja defibrinoitua karitsan verta ennen tarjoilua maljoille.

Elatusaineen lopullisen pH: n tulisi olla välillä 7,2-7,4.

Sijoita ja säilytä jääkaapissa, kunnes käytät. Anna levyn lämmetä huoneenlämpötilaan ennen käyttöä.

Valmistetun väliaineen väri on vaaleanbeige.

Sovellukset

Sitä käytetään suorittamaan antibiogrammi- tai antibioottiherkkyystesti nopeimmin kasvaville ei-vaativille patogeeneille.

Jos agaria täydennetään verellä, sitä käytetään vaadittavien mikro-organismien, kuten: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, antibiogrammin suorittamiseen. Sitä on käytetty myös Legionella pneumophilan eristämiseen.

Antibiogrammitekniikka

Ennen suorittamista antibiogram, bakteeri-liuos, joka vastaa 1,5 x 10 ⁸ solua täytyy olla valmis.

Tätä varten otetaan 3 - 4 puhtaan viljelmän pesäkettä ja suspendoidaan soijapavun tryptikaasiliemessä tai Müeller Hinton-liemessä, inkuboidaan 2 - 6 tuntia ja konsentraatio säädetään steriilillä suolaliuoksella vertaamalla sitä Mac Farland -standardiin, joka on 0,5%.

Jos ne vaativat mikro-organismeja, pesäkkeet voidaan suspendoida suoraan konsentraatioon 0,5% Mac Farland. Myöhemmin Müeller Hinton -levy ympätään tamponilla, joka on kyllästetty valmistetulla bakteeriliuoksella.

Tätä varten tamponi upotetaan liuokseen ja sitten ylimääräinen neste poistetaan puristamalla sitä putken seinämiä vasten. Välittömästi sen jälkeen tamponi kuljetetaan koko pinnan yli, jättämättä mitään paikkoja koskemattomiksi, sitten levyä pyöritetään hieman ja se kylvään uudelleen. Toisto toistetaan vielä 2 kertaa.

Annetaan seistä 10 minuuttia ja asetetaan sitten antibioottilevyt steriileillä pihdillä jättämällä niiden väliin 24 mm: n rako. Kun olet asettanut jokaisen levyn agarille, paina jokaista kiekkoa kevyesti pihdillä varmistaaksesi, että ne tarttuvat hyvin.

Kun prosessi on valmis, levy käännetään ylösalaisin ja inkuboidaan 35 - 37 ° C: ssa aerobioosissa 16-18 tuntia. Jos se on vaativa mikro-organismi, se voi ansaita mikroaerofiliaa ja jos antiiogrammi sisältää oksasilliinilevyjä, se tulisi lukea 24 tunnin kuluttua.

Viivainta käytetään mittaamaan kunkin halogeenin halkaisija. Tulokset tulee kirjata millimetreinä. Myöhemmin saadut arvot korreloidaan nykyisen CLSI-käsikirjan julkaisemien rajapistetaulukoiden kanssa.

Inhibitiohalon mittaus. Lähde: USCDCP, Pixnio.com

Ilmoita tapauksen mukaan arkaluontoisena (S), välituotteena (I) tai kestävänä (R).

Antibiootit valitaan eristetyn mikro-organismin ja sen aiheuttaman infektion tyypin mukaan.

Joskus antibioottien strateginen sijoittaminen on pidettävä mielessä fenotyyppisten resistenssikuvioiden paljastamiseksi.

Strateginen levyn sijoittelu Müeller Hinton-agarille

Enterobakteerien tapauksessa klavulaanihappokiekko tulisi asettaa kolmannen ja neljännen sukupolven kefalosporiinia vastaan. Munanmuotoinen laajeneminen osoittaa, että kanta on laaja-alaisten beeta-laktamaasien (ESBL) tuottaja. Tämä tarkoittaa, että potilasta ei tule hoitaa kefalosporiinilla.

Laajaspektrisen beeta-laktamaasin (ESBL) tuotannon fenotyyppinen ilmentyminen Escherichia coli -kannassa. Lähde: Kuva kirjoittanut MSc. Marielsa gil

Stafylokokissa on tärkeätä asettaa erytromysiini- tai atsitromysiinilevy klindamysiinilevyn eteen (D-testi).

Resistentti halogeeni erytromysiinissä ja litistyminen klindamysiinihalossa osoittavat, että kannalla on kannan aiheuttama klindamysiiniresistenssi (ICR). Tämä tarkoittaa, että klindamysiinihoito ei ole tehokasta.

Indusoitavien AMP C -kantojen etsimiseksi enterobakteereista ja joistakin käymättömistä gramnegatiivisista sauvoista tatsobaktaanikeftatsidiimi-, kefoksitiini- tai piperatsilliinilevyjä kohdellaan imipeneemilevyä kohden 27 mm: n etäisyydellä.

Levytty halo yhdessä imipeneemia kohti olevassa levyssä osoittaa indusoitavan AMP C: n läsnäolon.

Konstitutiivisen AMP C: n etsimiseksi 500 ug: n kloksatsilliinilevylle asetetaan keftatsidiimi (30 ug) ja kefotaksiimi (30 ug) 25 mm: n etäisyydellä. Minkä tahansa kefalosporiinien laajentunut halogeeni osoittaa positiivisuutta.

Kloasasilliinilevy voidaan myös korvata 9 mm: n levyllä Whatman nro 6 -suodatinpaperia, joka on kyllästetty fenyyliboorihapolla (400 ug) 18 mm: n etäisyydellä. Se tulkitaan samalla tavalla kuin edellinen.

Lopuksi metalllobetalaktamaamien tuotannon tutkimiseksi erityisesti Pseudomonas aeruginosassa käytetään levyä, joka on kyllästetty 10 pl: lla etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA 750 ug) ja tioglykolihappoa (SMA 300 µg), joka kohtaa imipeneemi- ja meropeneemilevyjä, 15 mm etäisyydellä.

Testi on positiivinen, jos imipeneemi tai meropeneemihalot leviävät kohti EDTA / SMA-levyä. Tämä tulos on vahvistettava muokatulla Hodge-testillä.

Tämä menetelmä käsittää Escherichia coli ATCC 25922 -kannan siirrostamisen Müeller Hinton -levylle. Imipeneemilevy asetetaan levyn keskelle ja sitten tehdään levy levyltä reunaan epäillyn P. aeruginosa -kannan kanssa. Jopa 4 kantaa voidaan testata levyä kohden.

Testi on positiivinen, jos venytysmerkin ympärillä on imipeneemin halogeenin vääristymisalue.

Virheellisten tulosten syyt

- Huonosti säilyneet antibioottilevyt voivat tuottaa väärää vastustuskykyä. Esimerkiksi oksasilliinilevy on erittäin herkkä lämpötilan muutoksille.

- Elatusaineen pH, joka on alle ilmoitetun (happama), tuottaa pienempiä halogeenejä aminoglykosideissa ja makrolideissa (väärän resistenssin riski) ja suurempia halogeeneja penisilliinissä, tetrasykliinissä ja novobiosiinissa (väärän herkkyyden riski).

-Jos pH on korkeampi kuin osoitettu (emäksinen), edellä kuvatut vaikutukset kääntyvät päinvastaiseksi.

-Media, jolla on korkeat tymiini- ja tymidiinipitoisuudet, vaikuttaa, koska vähentää merkittävästi sulfonamidien ja trimetoprimin inhibitiohalooja.

-Korkeat kalsium- ja magnesiumpitoisuudet aiheuttavat aminoglykosidien, polymyksiini B: n ja tetrasykliinien väärän vastustuskyvyn Pseudomonas aeruginosa -kantoja vastaan.

- Alhaiset kalsium- ja magnesiumpitoisuudet aiheuttavat vääriä aminoglykosidien, polymyksiini B: n ja tetrasykliinien herkkyyttä Pseudomonas aeruginosa -kantoja vastaan.

-Sinkin esiintyminen vaikuttaa karbapeneemi-levyjen (imipeneemi, meropeneemi ja ertapeneemi) tuloksiin.

- Alustan paksuus alle 3 mm tuottaa väärät herkkyystulokset, kun taas paksuus yli 5 tuottaa väärän vastuksen.

- Levyjen mobilisointi antiiogrammissa antaa muodonmuutoshaloja, koska antibioottien vapautuminen tapahtuu välittömästi.

- Hyvin heikot siirrot vaikuttavat tuloksiin, koska agarissa ei tapahdu tasaista tai yhtyvää kasvua, mikä on välttämätön edellytys inhibitiohalojen mittaamiseksi sen lisäksi, että halot voivat antaa normaalia suuremman.

- Yli ladattu ympyrä voi tuottaa normaalia pienempiä haloja.

-Etkö levyjen välisen etäisyyden kunnioittaminen aiheuttaa yhden halogeenin päällekkäisyyden toisen kanssa, eikä niitä voi lukea oikein.

-Incubate CO ₂ kasvaa koko haloja tetrasykliinin ja metisilliinille levyjä.

- Inkuboimalla alle 35 ° C: n lämpötiloissa saadaan suurempia halogeenejä.

- Veren lisääminen vähentää sulfahalogeenin kokoa.

rajoitus

Antibiogrammissa osoitettu antibiootin herkkyys mikro-organismille (in vitro) ei ole tae siitä, että se toimii in vivo.

QA

Jotta saadaan tietää, sisältääkö väliaine riittävästi tymiiniä, on istutettava Enterococcus faecalis ATCC 29212 -kanta ja testattava herkkyys trimetoprimisulfametoksatsolille (SXT). Sen on annettava halogeeni, joka on vähintään 20 mm, jotta se olisi tyydyttävä.

Viitteet

1. "Müller-Hinton-agar." Wikipedia, ilmainen tietosanakirja. 16. marraskuuta 2018, 12:23 UTC. 27. tammikuuta 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott: n mikrobiologinen diagnoosi. 12 toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
3. Cona E. Edellytykset hyvälle herkkyystutkimukselle agardiffuusiokokeella. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77 - 81
4. Difco Francisco Soria Melguizon laboratorio. Müeller Hinton-agar, jossa on 5% lampaan verta. 2009.Saatavilla osoitteessa:
5. BD Müeller Hinton II agarlaboratorio. 2017.Saatavilla osoitteessa:.bd.com
6. Britannia Laboratories. Müeller Hinton-agar. 2015.Saatavilla osoitteessa: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5. toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
8. Martínez-Rojas D. AmpC-tyyppiset beetalaktamaasit: Yleisyydet ja menetelmät fenotyyppien havaitsemiseksi. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78 - 83. Saatavana osoitteessa: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Metallobetalaktamaamien fenotyyppinen havaitseminen Pseudomonas aeruginosan kliinisissä isolaateissa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113 - 121. Saatavana osoitteessa: scielo.org.