TSI-AGAR: PERUSTEET, VALMISTELU JA KÄYTTÖ - BIOLOGIA - 2026

TSI-agarilla tai kolminkertainen sokeri rauta-agar on kiinteä alusta, joka toimii biokemiallinen koe ohjaamaan ensitunnistamiseen gram-negatiivisia basilleja. Se perustuu läsnä olevien sokerien käymisen osoittamiseen ja rikkivedyn ja kaasun tuottamiseen.

Sen koostumus ja perusta ovat hyvin samankaltaiset kuin Kligler-rautatesti, sillä erolla, että jälkimmäinen sisältää vain glukoosia ja laktoosia. Sen sijaan, kuten nimensä osoittaa, kolmoissokerinen rauta-agar sisältää kolme fermentoituvaa hiilihydraattia: glukoosia, laktoosia ja sakkaroosia.

Kuvia YTE-testistä erilaisilla mikro-organismeilla A. Escherichia coli, B. Shigella flexneri, C) Salmonella typhimurium, D. Pseudomonas aeruginosa. Lähde: Witmadrid, Wikimedia Commonsista

Lisäksi TSI-elatusaineessa on neljä proteiinijohdannaista, jotka tekevät siitä erittäin ravitsevan agarin: hiivauutteen, lihauutteen, peptonin ja protoosipeptonin. Se sisältää myös rautapitoista ammoniumsulfaattia, natriumtiosulfaattia, natriumkloridia, fenolipunaista ja agaria.

Mikro-organismin kyvyttömyys fermentoida väliaineessa olevaa glukoosia sulkee sen välittömästi pois Enterobacteriaceae-perheeseen. Siksi tämä testi on välttämätön päätettäessä, mikä tunnistusreitti valitaan sukujen ja lajien määrittämiseksi.

Jokainen laboratorio päättää työskennellä TSI-agarilla vai Kligler-rauta-agarilla.

Perusta

Jokainen yhdisteistä täyttää funktion väliaineessa.

Natriumkloridi ja agar

Natriumkloridi on välttämätön väliaineen osmoottisen tasapainon ylläpitämiseksi. Vaikka agar antaa kiinteän konsistenssin.

PH-indikaattori (fenolipunainen)

Valmistetun väliaineen pH on tasapainotettu arvoon 7,3 ja pH-indikaattori (fenolipunainen) muuttuu keltaiseksi alle 6,8. Tämä tarkoittaa, että pienet määrät happoja, joita syntyy sokerien käymisessä, muuttuvat väliaineesta puna-oranssista keltaiseksi.

Jos käymistä ei tapahdu, väliaine tapahtuu alkalisoituneena peptoneilla, muuttuen puna-oranssista voimakkaaseen punaiseksi.

Proteiinijohdannaiset (hiivauutetta, lihauutetta, peptonia ja protoosipeptonia)

Kun bakteerit metaboloivat TSI-agarissa esiintyviä proteiineja, tuotetaan amiineja, jotka alkaloivat väliainetta (pääasiassa viistetasolla), koska reaktio vaatii happea. Amiinit muuttavat kehyksen kirkkaan punaiseksi.

Mutta tämä riippuu bakteerien kyvystä käydä hiilihydraatteja vai ei.

Hiilihydraattien (glukoosin, laktoosin ja sakkaroosin) käyminen

Sokerien käymisen tutkimus voi antaa useita kuvia, ja jokainen tulkitaan eri tavalla. Koetulkinta jakaa mikro-organismit 3 luokkaan: glukoosittomat, laktoosittomat ja laktoosi / sakkaroosi-fermenteerit.

On huomattava, että glukoosin määrä väliaineessa on rajoitettu, kun taas laktoosin ja sakkaroosin pitoisuus on 10 kertaa suurempi.

Enterobakteriaceae-perheen bakteerit ja muut glukoosia fermentoivat mikro-organismit alkavat käydä tätä sokeria, koska se on energian yksinkertaisin hiilihydraatti.

Toisaalta laktoosi ja sakkaroosi ovat monimutkaisia ​​hiilihydraatteja, jotka on hajotettava ja muunnettava glukoosiksi, jotta ne pääsevät Embden-Meyerhof-kiertoon.

-Mikro-organismit, jotka eivät fermentoi glukoosia

Kun ymppätty mikro-organismi ei pysty fermentoimaan glukoosia, se pystyy fermentoimaan paljon vähemmän hiilihydraatteja paljon vähemmän. Siksi tässä ei muodostu happoja, mutta viineissä muodostuu amiineja peptoneja käyttämällä.

Tässä tapauksessa kehys muuttuu voimakkaammaksi punaiseksi ja putken pohja voi pysyä muuttumattomana tai se voi olla myös emäksinen, jolloin koko putki jää punaiseksi.

Tulkinta: K / K tarkoittaa alkalista viistettä / alkalista tai neutraalia pohjaa

Katso artikkelin alussa olevasta kuvasta kuva putkesta D.

Tämä tulos osoittaa, että mikro-organismi ei kuulu Enterobacteriaceae-perheeseen.

-Mikro-organismit, jotka eivät fermentoi laktoosia / sakkaroosia

Jos bakteerit kykenevät fermentoimaan glukoosia, mutta eivät laktoosia tai sakkaroosia, tapahtuu seuraava:

Bakteerit kuluttavat kaiken läsnä olevan glukoosin noin 6 - 8 tunnin kuluttua, jolloin ne pystyvät happamaan sekä viisteen että lohkon; eli agar on muuttunut täysin keltaiseksi. Mutta kun glukoosi on tyhjentynyt eikä laktoosia ja sakkaroosia voida käyttää, bakteerit aloittavat proteiinien metabolian.

Tämä reaktio tarvitsee happea, joten peptonien hajoaminen tapahtuu pinnalla (viiste). Tuotetut amiinit alkalisoivat kehyksen muuttuessa keltaisesta punaiseksi. Tämä reaktio ilmenee 18 - 24 tunnin inkubaation jälkeen.

Tulkinta: K / A tarkoittaa alkalista viistettä ja hapan vanua.

Katso artikkelin alussa olevasta kuvasta putken B kuva.

-Laktoosia / sakkaroosia fermentoivat mikro-organismit

Mikro-organismit, jotka kykenevät fermentoimaan laktoosia ja sakkaroosia, voivat ilmeisesti fermentoida glukoosia. Sen jälkeen kun väliaineessa olevan vähimmäismäärän glukoosia on käytetty loppuun, muodostunut pyruvaatti alkaa metaboloitua happojen muodostumiseksi aerobisen Krebs-syklin läpi, ja 8 - 12 tunnin aikana kaikki väliaine on keltaista.

Jos bakteerit kykenevät hajottamaan laktoosin tai sakkaroosin, happoja tuotetaan edelleen, ja 18 - 24 tunnin kuluttua koko putki - viiste ja tulppa - jatkavat keltaista.

On huomattava, että glukoosin käyttö tapahtuu kahdella tavalla: yksi aerobisesti putken viistossa ja toinen anaerobisesti putken alaosassa.

Tulkinta: A / A tarkoittaa hapan viistettä / hapan pohjaa. Siinä voi olla kaasua tai ei.

Katso artikkelin alussa olevasta kuvasta putken A kuva.

Kaasun tuotanto

Jotkut mikro-organismit kykenevät tuottamaan kaasua sokerien käymisen aikana. Kaasun todistaa putkessa sen aiheuttama paine agarissa. Paine aiheuttaa kuplan muodostumisen tai agarin siirtymisen. Joskus kaasun muodostuminen voi murtaa väliaineen.

On tärkeää, että TSI-väliaineen kylvön yhteydessä puhkaisu tehdään puhtaasti agarin keskellä, kunnes se saavuttaa pohjan. Jos puhkaisu suunnataan putken seinämiä kohti, se voi aiheuttaa vääriä positiivisia tuloksia kaasun tuotannossa, koska se karkaa väärin muodostetun kanavan läpi.

Kaasuntuotanto samoin kuin agar-viisteessä tapahtuvat reaktiot tarvitsevat happea, siksi on suositeltavaa, että putki peitetään puuvillatulpalla, ja jos käytetään bakeliittiluukkua, sen ei tulisi olla täysin tiukka.

Kaasuntuotanto ilmoitetaan positiivisena (+) tai negatiivisena (-).

Kaasunmuodostustavat. Lähde: MSc: n suunnitelma. Marielsa Gil. Kuvalähde: VeeDunnFlickr.com/Y_tambe, Wikimedia Commonsin kautta

Natriumtiosulfaatti ja rautametallisulfaatti

Bakteerit, jotka pystyvät tuottamaan rikkivetyä (väritöntä kaasua), ottavat rikkiä elatusaineessa olevasta natriumtiosulfaatista. Kun H ₂ S on muodostettu, se reagoi ferroammoniumsulfaattia, tuottavat rauta sulfidi (selvästi näkyvissä musta sakka).

H ₂ S -tuotanto ilmoitetaan positiivisena (+) tai negatiivisena (-).

Katso artikkelin alussa olevasta kuvasta putken C kuva.

Valmistautuminen

Punnitaan 62,5 g dehydratoitua kolmoissokerista rauta-agar-väliainetta (TSI) ja liuotetaan litraan tislattua vettä.

Kuumenna, kunnes agar on täysin liuennut. Keitä minuutti sekoittaen usein. Levitä 4 ml väliainetta 13/100-koeputkiin puuvillakorkkeilla.

Steriloidaan autoklaavissa 121 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Poista autoklaavista ja anna sen levätä kulmassa. On varmistettava, että sekä jalustalla että kehällä on sama etäisyys.

Säilytä jääkaapissa 2-8 ° C. Anna sen lämmetä ennen kylvää bakteerikantaa.

Kuivatun väliaineen väri on vaaleanbeige ja valmistettu väliaine on puna-oranssi.

Valmistetun väliaineen lopullinen pH on 7,3 ± 0,2.

Sovellukset

TSI-testiä käytetään laajasti mikrobiologian laboratorion tasolla. Tämä testi on välttämätön ohjattaessa testityyppiä, joka on suoritettava suvun ja lajin tunnistamiseksi. Sen hyvä toteutus ja tulkinta voi säästää materiaalia ja työvoimaa.

Jos tulos on TSI K / K ja sytokromioksidaasitesti on positiivinen, tiedetään, että testejä tulisi käyttää käymättömien gramnegatiivisten sauvojen, kuten Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia, tunnistamiseen muiden sukujen joukossa. Jos se on oksidaasinegatiivinen, se on suuntautunut sukuihin Acinetobacter, Stenotrophomonas jne.

Toisaalta, jos saadaan TSI A / A tai K / A ja sytokromioksidaasitesti on negatiivinen, sitä enemmän nitraatteja vähenee nitriiteiksi, olemme varmoja, että kyseessä on Enterobacteriaceae-perheeseen kuuluva mikro-organismi. Tässä tapauksessa tunnistusreitti keskittyy tämän bakteeriryhmän erityisiin testeihin.

Toisaalta, jos saadaan K / A- tai A / A-kuva ja sytokromioksidaasitesti on positiivinen, koottavilla lisätesteillä pyritään tunnistamaan käymiskannat, jotka eivät kuulu Enterobakteriaceae-perheeseen, kuten: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio ja Pasteurella.

Oksidaasinegatiivisella rikkivedyllä varustettua TSI: tä seuraavien Enterobacteriaceae-sukujen suvun tunnistamiseksi: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella tai Salmonella.

TSI vähän tai kohtalaisesti rikkivedyn emäksinen viiste alkalisella tausta ja positiivinen oksidaasi, ohjaa käyttämällä testejä, tunnistamiseksi ei-fermentoimaan gramnegatiiviset sauvat tuottaa H ₂ S, kuten Shewanella putrefaciens.

Lopuksi, TSI: tä voidaan käyttää tutkimaan rikkivetytuotannon tutkimuksia grampositiivisissa Bacilli-bakteereissa, etenkin kun epäillään Erysipelothrix rhusiopathiae -bakteereita.

kylvetty

TSI-alusta on inokuloitava puhtaisiin pesäkkeisiin, eristetty primaarisissa tai selektiivisissä viljelmissä. Jos pesäke otetaan selektiivisistä väliaineista, joille kylvettiin näytteet, joissa oli sekoitettuja kasvistoja, on huolehdittava siitä, että otetaan vain pinnalta, koska kyseisessä väliaineessa estettyjä elinkelpoisia kantoja voi esiintyä siirtokunnan alaosassa.

Siksi silmukkaa ei tulisi koskaan jäähdyttää selektiivisellä väliaineella, ja sitten pesäke otetaan ja inokuloidaan TSI-väliaineella.

Kylvö tehdään suoralla silmukalla tai neulalla. Lävistys tehdään huolehtimalla siitä, että se kulkee keskellä olevan keskipisteen läpi pohjan saavuttamiseen, ja sitten kylvö päätetään inokuloimalla pinta siksak-muotoiseen. Älä tee kahta puhkaisua.

Inkuboi 37 ° C: ssa aerobioosissa 18 - 24 tuntia. Tulkitse tällä hetkellä, ei ennen eikä jälkeen.

rajoitukset

YTE-testi tulisi lukea 18–24 tunnin sisällä inkuboinnista. Ennen tätä aikaa lukema voi antaa väärän positiivisen A / A-käymiselle. Tämän jälkeen lukema voi johtaa väärään negatiiviseen kuvaan käymättömästä fermenterista johtuen väliaineen alkaloivien peptonien kulutuksesta.

Viitteet

1. Mac Faddin J. (2003). Biokemialliset testit kliinisesti tärkeiden bakteerien tunnistamiseksi. 3. toim. Toimituksellinen Panamericana. Buenos Aires. Argentiina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott: n mikrobiologinen diagnoosi. 12 toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5. toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
4. "TSI agar." Wikipedia, ilmainen tietosanakirja. 10. heinäkuuta 2018, 08:09 UTC. 10. helmikuuta 2019, 03:33. Saatavana: es.wikipedia.org
5. Britannia Laboratories. TSI-agar (kolminkertainen sokerirauta-agar). 2015.Saatavilla osoitteessa: britanialab.com
6. BD Laboratories. Kolminkertainen sokerirauta-agar (TSI-agar). 2003.Saatavilla osoitteessa: bd.com