IMMUNOFLUORESENSSI: PERUSTEET, PROTOKOLLA JA SOVELLUKSET - BIOLOGIA - 2026

Immunofluoresenssi on tehokas tekniikka immunovärjäämällä käyttämällä vasta-aineita on sitoutunut kovalenttisesti fluoresoivat molekyylit tunnistaa erityisiä tavoitteita solunäytteissä kiinnitetty kiinteään kantajaan.

Tämä tekniikka sisältää mikroskooppisen havainnon immunologisella spesifisyydellä, mikä mahdollistaa elävien tai kuolleiden solujen tarkkailun, joissa voi esiintyä pieniä määriä antigeenejä. Sitä käytetään laajalti sekä tutkimusalalla että erilaisten patologioiden kliinisessä diagnoosissa.

Aktiinilankojen immunomerkinnät sydänsolujen soluissa (Lähde: Ps1415 Wikimedia Commonsin kautta)

Tämän tekniikan, lähinnä kvalitatiivisen (joillakin kvantitatiivisilla muunnelmilla), täytyy liittyä erityisesti näytteen visualisointiin fluoroforin tuotesignaalilla, joka on vasta-aineeseen sitoutunut fluoresoiva molekyyli ja joka kykenee herättämään tietyllä aallonpituudella..

Soluyhteydessä on erittäin hyödyllistä tutkia proteiinien läsnäoloa / puuttumista ja solun sijaintia. Tekniikkaa käytettiin alun perin kliinisissä olosuhteissa virusten, kuten influenssan, diagnoosissa ja myöhemmin monien muiden tartuntatautien hoidossa.

Se on erittäin herkkä tekniikka, ja sopivilla mikroskopialaitteilla se voi olla erittäin hyvä resoluutio. Se vaatii havaintoa varten konfokaalisten tai epifluoresenssimikroskooppien käyttämistä.

Siitä huolimatta, että se on erittäin suosittu, se voi kuitenkin aiheuttaa joitain tärkeitä ongelmia epäspesifisen fluoresenssin saamiseksi, joka tuottaa jonkin verran taustamelua, mikä usein rajoittaa tulosten riittävää lukemista.

Perusta

Immunofluoresenssi perustuu vasta-aineen ja antigeenin vuorovaikutusreaktion biologisen ilmiön hyödyntämiseen. Sillä on erityisesti tehtävä tämän reaktion visualisointi tai havaitseminen kiehtovilla fluoresoivilla molekyyleillä tiettyyn aallonpituuteen.

Vasta-aine on aktiivisista B-soluista erittyvä immunoglobuliiniproteiini, joka tuotetaan spesifisesti antigeeniä vastaan ​​ja johon se voi sitoutua suurella affiniteetilla ja spesifisyydellä. Immunofluoresenssissa käytetään IgG-immunoglobuliineja, joiden havaitaan liukenevan vereseerumiin.

Vasta-aineet ovat korkeintaan 950 kDa: n molekyylejä, jotka koostuvat kahdesta lyhyestä (kevyestä) ja kahdesta pitkästä “Y” -muotoisesta (raskas) peptidiketjusta. Sekä kevyt että raskas ketju on jaettu kahteen domeeniin: yksi muuttuja, joka kykenee tunnistamaan antigeenin, ja toinen vakio tai konservoitunut, jokaiselle lajille ominainen.

Antigeenit määritellään toiminnallisesti molekyyleinä, jotka vasta-aine voi tunnistaa ja jotka ovat suurimmaksi osaksi proteiineja. Kun eläin altistetaan antigeenille, immuunijärjestelmän lymfosyytit aktivoituvat, mikä tuottaa spesifisiä vasta-aineita sitä vastaan ​​ja joka toimii puolustusjärjestelmänä.

Antigeenillä, kuten esimerkiksi proteiinilla, voi olla useampi kuin yksi epitooppi tai kohta, jonka vasta-aine tunnistaa, siten antigeenille altistetun eläimen seerumilla voi olla polyklonaalisia vasta-aineita saman proteiinin eri alueita vastaan.

Sitten immunofluoresenssi hyödyntää eläimen kykyä tuottaa polyklonaalisia vasta-aineita tiettyä antigeeniä vastaan ​​sen puhdistamiseksi ja käyttää sitä myöhemmin saman antigeenin havaitsemiseksi muissa yhteyksissä.

Joihinkin immunofluoresenssitekniikoihin eniten käytettyjen fluoresoivien väriaineiden tai molekyylien joukossa ovat fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC), tetrametyylirrodamiini-isotiosyanaatti-5 ja 6 (TRITC), monet syaanit, kuten Cy2, Cy3, Cy5 ja Cy7, sekä väriaineet, joita kutsutaan Alexa Fluor®., kuten Alexa Fluor®448.

protokolla

Immunofluoresenssiprotokolla vaihtelee monien tekijöiden mukaan, mutta yleisesti ottaen se sisältää lineaarisen vaihejärjestyksen, joka koostuu:

• Levyjen ja solujen valmistus
• Näytteiden kiinnitys
• permeabilisaatio
• esto
• Immuunivärjäys tai immunovärjäys
• Kokoonpano ja havainnot

-Valmistautuminen

Näytteistä

Näytteiden valmistelu riippuu niiden luonteesta ja suoritettavasta kokemuksesta. Seuraavassa selitetään yksinkertaisin tapaus, johon sisältyy solujen käyttö suspensioissa.

Suspensiossa olevat solut, ts. Nestemäisessä viljelyväliaineessa, on ensin erotettava siitä sentrifugoimalla ja sitten pestävä puskuriliuoksella tai isosmoottisella "puskurilla", joka säilyttää niiden eheyden.

Normaalisti käytetään fosfaatti-suolaliuospuskuria, joka tunnetaan nimellä PBS, jossa solut suspendoidaan uudelleen ja tämä seos sentrifugoidaan uudelleen solujen saamiseksi, jotka eivät sisällä viljelyväliainetta, joka voi sisältää häiritseviä aineita.

Teristä

Mikroskooppiseen havainnointiin tarkoitetut levyt, joissa solut myöhemmin kiinnitetään vastaavia alavirran käsittelyjä varten, on myös valmistettava huolellisesti.

Ne peitetään tai "herkistetään" polylysiiniliuoksella, synteettisellä polymeerillä, joka toimii "molekyylisellä liimana" solujen ja kiinteän kantajan välillä, johtuen niiden aminoryhmien positiivisten varausten ja negatiiviset varaukset proteiineille, jotka peittävät solut.

Näytteiden kiinnitys

Tämä prosessi koostuu solun sisällä olevien proteiinien immobilisoinnista niiden tilallisen sijainnin pitämiseksi ehjänä. Käytettyjen molekyylien on kyettävä ylittämään kaiken tyyppiset solukalvot ja muodostamaan hilat kovalenttisten proteiinien kanssa.

Formaldehydiä ja paraformaldehydiä, glutaraldehydiä ja jopa metanolia käytetään laajalti, joiden kanssa solunäytteitä inkuboidaan tietyn ajan ja pestään sitten isosmoottisella puskuriliuoksella.

Solujen kiinnittämisen jälkeen ne kiinnittyvät edelleen levyihin, jotka on aiemmin herkistetty polylysiinillä.

permeabilisaatio

Suoritetun testin tyypistä riippuen on tarpeen permeabilisoida tutkittavat solut tai ei. Jos halutaan tietää tietyn proteiinin sijainti, esiintyminen tai puuttuminen solun pinnalla, läpäisevyyttä ei tarvita.

Toisaalta, jos haluat tietää proteiinin sijainnin solun sisällä, läpäisevyys on välttämätöntä ja se koostuu näytteiden inkuboinnista Triton X-100: n kanssa, joka on pesuaine, joka kykenee läpäisemään solumembraanit.

esto

Perusaskel kaikissa immunologisissa tekniikoissa on estäminen. Menetelmän tässä vaiheessa estäminen käsittää sen, että herkistetyille levyille peitetään kaikki kohdat poly-lysiinimolekyyleillä, joihin solut eivät kiinnittyneet. Toisin sanoen se estää epäspesifisen liiton.

Normaalisti estämiseen käytetään liuoksia, joissa on naudan seerumialbumiinia (BSA) PBS-puskurissa, ja parhaat tulokset saavutetaan, mitä pidempi inkubaatioaika tämän liuoksen kanssa. Jokaisen vaiheen jälkeen, mukaan lukien esto, on tarpeen pestä loput liuos.

Immuunivärjäys tai immunovärjäys

Immunovärjäys- tai immunovärjäysmenetelmä riippuu pääasiassa siitä, onko se suora tai epäsuora immunofluoresenssi (katso alla).

Jos se on primaarinen tai suora immunofluoresenssi, näytteitä inkuboidaan haluttujen vasta-aineiden kanssa, jotka on kytkettävä fluoresoiviin väriaineisiin. Inkubointimenettely koostuu vasta-aineen laimentamisesta liuokseen, joka sisältää myös BSA: ta, mutta pienemmässä suhteessa.

Kun kyse on sekundaarisesta tai epäsuorasta immunofluoresenssista, tulisi suorittaa kaksi peräkkäistä inkubaatiota. Ensin halutuilla vasta-aineilla ja sitten vasta-aineilla, jotka kykenevät havaitsemaan primaaristen immunoglobuliinien vakioalueet. Juuri nämä sekundaariset vasta-aineet sitoutuvat kovalenttisesti fluoroforeihin.

Tekniikka on erittäin monipuolinen, mikä mahdollistaa useamman kuin yhden antigeenin samanaikaisen leimaamisen näytettä kohden, kunhan on primaarisia vasta-aineita, jotka on kytketty erilaisiin fluoroforeihin, suoran immunofluoresenssin tapauksessa.

Samanaikaista merkitsemistä varten epäsuorassa immunofluoresenssissa on välttämätöntä varmistaa, että jokainen primaarinen vasta-aine tuotetaan eri eläimessä, samoin kuin että jokainen sekundaarinen vasta-aine on kytketty erilaiseen fluorofooriin.

Kuten estäminen, inkubointi vasta-aineiden kanssa antaa parempia tuloksia, mitä pidempi tämä on. Jokaisen vaiheen jälkeen on tarpeen pestä ylimääräiset vasta-aineet, jotka eivät sitoutuneet näytteisiin, ja sekundaarisessa immunofluoresenssissa on tarpeen estää ennen sekundäärisen vasta-aineen lisäämistä.

Tietyt tekniikat käyttävät muita tahroja, jotka eivät liity immunovärjäykseen, kuten ydin-DNA: n värjääminen DAPI-fluoroforilla.

Kokoonpano ja havainnot

Viimeisen inkubaation aikana fluoroforien kanssa on välttämätöntä, että näytteet pysyvät pimeässä. Mikroskooppista tarkkailua varten on yleistä käyttää joitain aineita vasta-aineisiin kytkettyjen fluoroforien fluoresenssin säilyttämiseksi.

Tyypit

Graafinen yhteenveto suorasta ja epäsuorasta immunofluoresenssista (Lähde: Westhayl618 Wikimedia Commonsin kautta)

Suora tai primaarinen immunofluoresenssi

Se liittyy antigeenien havaitsemiseen fluoresoivien vasta-aineiden avulla. Tämän tekniikan käytön tärkein etu on sen nopeus, mutta prosessissa voi tapahtua monia tapauksia, joissa ei ole spesifistä sitoutumista, etenkin tutkittaessa ihmisen seerumeita, koska ne ovat rikkaita erittäin heterogeenisistä vasta-aineista.

Epäsuora tai sekundaarinen immunofluoresenssi

Se tunnetaan myös nimellä "voileipä" tekniikka, ja tähän sisältyy tekniikan kehittäminen kahdessa vaiheessa. Ensimmäinen liittyy ei-fluoresoivan vasta-aineen käyttöön ja sen sitoutumiseen kiinnostuksen kohteena olevaan antigeeniin.

Tämän ensimmäisen vasta-aineen (joka toimii nyt antigeeninä) vakioaluetta vastaan ​​käytetään toista vasta-ainetta, joka kykenee tunnistamaan sen, joka liittyy fluoresoivaan molekyyliin.

Fluoresoivan signaalin esiintyminen on tulosta spesifisestä tunnistamisesta ensimmäisen fluoresoimattoman vasta-aineen ja kiinnostuksen kohteena olevan antigeenin välillä; tämän ensimmäisen vasta-aineen läsnäolo ehdottaa toisen vasta-aineen läsnäolon, joka on leimattu ja jonka ansiosta antigeenin läsnäolo tai puuttuminen voidaan määrittää.

Siitä huolimatta, että tekniikka on paljon aikaa vievämpi tekniikka kuin suora immunofluoresenssi (koska se sisältää vielä yhden inkubaatiovaiheen), tämä tekniikka ei sisällä fluoresoivan vasta-aineen suunnittelua jokaiselle tutkitulle antigeenille, mikä johtaa taloudellisesti elinkelpoisempi.

Lisäksi se on herkempi tekniikka signaalin vahvistumisen kannalta, koska useampi kuin yksi sekundaarinen vasta-aine voi sitoutua primaarisen vasta-aineen vakioalueeseen, vahvistaen siten fluoresoivan signaalin voimakkuutta.

Sovellukset

Kuten aikaisemmin on voitu huomata, immunofluoresenssi on erittäin monipuolinen tekniikka, jota on käytetty monin tavoin tieteellisellä ja kliinisellä alalla. Sitä voidaan käyttää vastaamaan ekologisia, geneettisiä ja fysiologisia kysymyksiä, jotka koskevat monia organismeja.

Kliinisissä sovelluksissa sitä käytetään joidenkin dermatologisten sairauksien välittömään diagnoosiin joko käyttämällä suoraa tai epäsuoraa immunofluoresenssia tutkittujen potilaiden epiteelikudoksessa.

Immunfluoresenssitekniikoita on ollut saatavana yksisoluisissa organismeissa, kuten hiivassa, intiaytumaisten ja sytoplasmisten mikrotubulusten, aktiinin ja niihin liittyvien proteiinien, 10 nm: n filamenttien ja muiden sytoplasman, kalvon ja soluseinien ainesosien visualisoimiseksi.

Viitteet

1. Abcam, immunosytokemia ja immunofluoresenssiprotokolla. Haettu osoitteesta abcam.com
2. Greph, C. (2012). Fluoresoivat väriaineet. Haettu osoitteesta leica-microsystems.com
3. Miller, DM, & Shakest, DC (1995). Immunofluoresenssimikroskopia. Julkaisussa Methods in Cell Biology (osa 48, sivut 365–394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID, & Cook, D. (2013). Immunofluoresenssitekniikat. Journal of Investigative Dermatology, 133, s. 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, ja Brian, K. (1991). Hiivan immunofluoresenssimenetelmät. Julkaisussa Methods of Enzymology (osa 194, s. 565–602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V, ja Widelock, D. (1964). Immunofluoresenssin sovellukset kansanterveyden virologiassa. Bakteriologiset arvostelut, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG, ja Anderson, DM (1996). Immunofluoresenssi kasviplanktonitutkimuksessa: sovellukset ja potentiaalit. J: Phycol., 32, 1–16.