MEDIO: PERUSTEET, VALMISTELU, KÄYTÖT JA RAJOITUKSET - BIOLOGIA - 2026

OF tai glukoosia fermentoimalla väliainetta on puolikiinteäagarmenetelmällä erityisesti suunniteltu tutkimus oksidatiivisen ja fermentatiivinen hiilihydraattien tärkeässä ryhmässä muita mikro-organismeja kuin Enterobacteriaceae, kutsutaan ei-enteerisesti gram-negatiivisia basilleja.

Sen ovat luoneet Hugh ja Leifson; nämä tutkijat ymmärsivät, että tavanomaiset menetelmät hiilihydraattien hapontuotannon tutkimiseksi eivät sovellu tähän bakteeriryhmään.

A. Kaupallisen väliaineen kaupallinen perusosa. B. Putket, joissa on väliaineella kylvettyjä. Lähde: A ja B Kuvat kirjoittanut tekijä MSc. Marielsa Gil.

Tämä johtuu siitä, että ei-enteeriset gram-negatiiviset sauvat tuottavat yleensä pieniä määriä happoja, toisin kuin enterobakteerit.

Tässä mielessä OF-väliaineella on erityisominaisuuksia, jotka voivat havaita muodostuneen pienen määrän happoja, sekä hapettumis- että käymisreiteillä. Nämä erot liittyvät peptonien, hiilihydraattien ja agarin määrään.

Tämä väliaine sisältää vähemmän peptoneja ja korkeamman pitoisuuden hiilihydraatteja, vähentäen siten tuotteita, jotka alkaloivat elatusainetta proteiinimetabolian seurauksena, ja lisäävät happojen tuotantoa hiilihydraattien käytöstä johtuen.

Toisaalta agarin määrän vähentyminen suosii tuotetun hapon leviämistä koko väliaineeseen sen lisäksi, että annamme mahdollisuuden tarkkailla liikkuvuutta.

OF-väliaine koostuu peptonista, natriumkloridista, bromitymolisinisestä, dikaliumfosfaatista, agarista ja hiilihydraatista. Yleisin hiilihydraatti on glukoosi, mutta muita voidaan käyttää tutkittavan mukaan, kuten laktoosi, maltoosi, ksyloosi.

Perusta

Kuten minkä tahansa kasvualustan, OF-väliaineen on sisällettävä ravintoaineita, jotka takaavat bakteerien kasvun; nämä aineet ovat peptoneja.

Hiilihydraatti puolestaan ​​tarjoaa energiaa ja samalla tutkitaan mikro-organismin käyttäytymistä sitä vastaan, ts. Sen avulla bakteerit voidaan luokitella hapettavaksi, fermentoivaksi tai ei-sakkarolyyttiseksi organismiksi.

OF-väliaine sisältää 1: 5-peptoni / hiilihydraatti -suhteen, toisin kuin 2: 1 tavanomaiset väliaineet. Tämä varmistaa, että peptonien hajoamisesta muodostuvien alkalisten amiinien määrä ei neutraloi heikkojen happojen muodostumista.

Toisaalta väliaine sisältää natriumkloridia ja dikaliumfosfaattia. Nämä yhdisteet stabiloivat väliaineen osmoottisesti ja säätelevät vastaavasti pH: ta. Bromitymolisininen on pH-indikaattori, joka muuttaa väliaineen värin vihreästä keltaiseksi tuottamalla happoa.

Jotkut mikro-organismit voivat käyttää hiilihydraatteja hapetus- tai käymisreittien kautta, kun taas toiset eivät kulje kumpaakaan reittiä.

Tämä riippuu kunkin mikro-organismin ominaisuuksista. Esimerkiksi jotkut tiukat aerobiset mikro-organismit voivat hapettaa tiettyjä hiilihydraatteja, ja fakultatiiviset anaerobit voivat hapettaa ja fermentoida ympäröivästä ympäristöstä riippuen, kun taas toiset eivät hapetta tai käydä hiilihydraatteja (asakarolyyttisiä).

Lopuksi CDC: n suosittelemaa OF-väliainetta muutetaan, joka sisältää erityisen OF-emäksen indikaattorina fenolipunaista.

Hapetusprosessi

Glukoosin hapetusprosessi ei vaadi glukoosin fosforylointia, samoin kuin käymisprosessi. Tässä tapauksessa aldehydiryhmä hapetetaan karboksyyliryhmäksi, mikä johtaa glukonihappoon. Tämä puolestaan ​​hapetetaan 2-ketoglukonihapoksi.

Jälkimmäinen joko kerääntyy tai hajoaa kahdeksi pyruvichappomolekyyliksi. Tämä järjestelmä vaatii hapen tai jonkin epäorgaanisen yhdisteen läsnäolon lopullisena elektroniakseptorina.

Happojen tuotanto tällä reitillä on heikompaa kuin käymisreitillä saatu.

Käymisprosessi

Jotta glukoosin fermentaatio tapahtuu jollain käytettävissä olevista reiteistä, se on ensin fosforyloitava, muuttuen glukoosi-6-fosfaatiksi.

Glukoosikäynnistys voi viedä useita reittejä, joista tärkein on Embden-Meyerhof-Parnas -reitti, mutta ne voivat myös kulkea Entner-Doudoroff-reitin tai Warburg-Dickens-heksoosimonofosfaattireitin, joka tunnetaan myös nimellä pentoosien hajoamisesta.

Valittu reitti riippuu mikro-organismin hallussa olevasta entsymaattisesta järjestelmästä.

Embden-Meyerhof- Parnasin kautta

Fermentoimalla glukoosia Embden-Meyerhof-Parnas -reitin läpi, se jaetaan kahteen triosimolekyyliin, jotka myöhemmin hajoutetaan erilaisiksi hiiliyhdisteiksi, kunnes muodostuu glyseraldehydi-3-fosfaattia. Sieltä tulee välituote, joka on pyruviinihappo.

Sieltä muodostuu erityyppisiä sekahappoja, jotka voivat vaihdella lajeittain.

Tämä järjestelmä esiintyy ilman happea ja vaatii orgaanisen yhdisteen lopullisena elektroniakseptorina.

Entner-Doudoroff -polku

Fermentoitaessa glukoosia Entner-Doudoroff-reitin kautta glukoosi-6-fosfaatista tulee glukoni-ᵼ-laktoni-6-fosfaattia ja sieltä se hapettuu 6-fosfo-glukonaatiksi ja 2-keto-3-deoksi-6- fosfoglukonaattia, jolloin lopulta muodostuu pyruviinihappo. Tämä reitti tarvitsee happea glykolyysin tapahtumiseksi.

Pentoosien hajoamisreitti tai Warburg-Dickens Hexoxa -monofosfaattireitti

Tämä reitti on hybridi kahdesta yllä olevasta. Se alkaa samalla tavalla kuin Entner-Doudoroff-polku, mutta myöhemmin glyseraldehydi-3-fosfaatti muodostuu pyruviinihapon edeltäjäksi, kuten tapahtuu Embden-Meyerhof-Parnas -polulla.

Valmistautuminen

Punnita:

2 g peptonia

5 g natriumkloridia

10 g D-glukoosia (tai valmistettavaa hiilihydraattia)

0,03 g bromitymolisinistä

3 g agaria

0,30 g dikaliumfosfaattia

1 litra tislattua vettä.

Sekoitetaan kaikki yhdisteet paitsi hiilihydraatti ja liuotetaan 1 litraan tislattua vettä. Kuumenna ja ravista, kunnes se on täysin liuennut.

Jäähdytettäessä 50 ° C: seen lisätään 100 ml 10-prosenttista glukoosia (suodatettu).

Levitä aseptisesti 5 ml väliainetta puuvillakorkisiin koeputkiin ja autoklaavi 121 ° C: n paineessa 15 naulaan 15 minuutin ajan.

Anna jähmettyä pystysuorassa asennossa.

Elatusaineen pH: n tulisi olla 7,1. Valmistetun elatusaineen väri on vihreä.

Säilytä jääkaapissa.

Sovellukset

OF-väliaine on erityinen väliaine mikro-organismin metabolisen käyttäytymisen määrittämiseksi hiilihydraattia vastaan. Varsinkin niille, jotka muodostavat vähän, heikkoja tai ei lainkaan happoja.

kylvetty

Kullekin mikro-organismille tarvitaan 2 OF-putkea, molemmat on inokuloitava tutkittavaan mikro-organismiin. Pesäke otetaan suoralla kahvalla ja reikä tehdään putken keskelle saavuttamatta pohjaa; Useita lävistyksiä voidaan tehdä, kunhan ei ole kiinnostusta tarkkailla liikkuvuutta.

Yhden putken päälle lisätään kerros steriiliä nestemäistä vaseliinia tai steriiliä sulatettua parafiinia (noin 1 - 2 ml) ja merkitty kirjaimella "F". Toinen putki jätetään alkuperäiseksi ja siinä on merkintä "O". Molempia putkia inkuboidaan 35 ° C: ssa ja tarkkaillaan päivittäin 3 - 4 päivän ajan.

Tulkinta

Aineenvaihdunta ja kaasuntuotanto

Taulukko: Mikro-organismien luokittelu niiden käyttäytymisen perusteella putkien avoimissa (oksidatiivisissa) ja suljetuissa (käymisvaiheissa)

Lähde: Tekijä MSc. Marielsa gil

Kaasua tarkkaillaan kuplien muodostumisen tai agarin siirtymisen seurauksena.

On huomattava, että organismi, joka vain hapettaa glukoosia, mutta ei käy siitä, ei pysty fermentoimaan muita hiilihydraatteja, joka tapauksessa se vain hapettaa sen. Siksi tässä tilanteessa suljettu putki muiden hiilihydraattien tutkimiseksi jätetään pois.

Motility

Lisäksi liikkuvuus voidaan nähdä OF-väliaineessa.

Positiivinen liikkuvuus: kasvu, joka ei rajoitu inokulaation alueeseen. Putken sivuja kohti on kasvua.

Negatiivinen liikkuvuus: kasvu vain alkuperäisessä siirrossa.

QA

Seuraavia kantoja voidaan käyttää laadunvalvontaan: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ja Moraxella sp. Odotetut tulokset ovat:

1. coli: glukoosi-fermentoija (sekä keltaiset että kuohuviinit).
2. aeruginosa: Glukoosin hapetin (avoin keltainen putki ja vihreä tai sininen sinetti).
3. Moraxella sp: Ei sakkarolyyttinen (vihreä tai sininen avoin putki, vihreänä suljettu putki).

rajoitukset

-Jotkut mikro-organismit eivät voi kasvaa OF-väliaineessa. Näissä tapauksissa testi toistetaan, mutta väliaineeseen lisätään 2% seerumia tai 0,1% hiivauutetta.

- Hapettumisreaktioita havaitaan usein vain lähellä pintaa ja muu väliaine voi jäädä vihreäksi, samalla tavalla kuin sen pidetään positiivisena.

Viitteet

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5. toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott: n mikrobiologinen diagnoosi. 12 toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Biokemialliset testit kliinisesti tärkeiden bakteerien tunnistamiseksi. 3. toim. Toimituksellinen Panamericana. Buenos Aires. Argentiina.
4. Francisco Soria Melguizo Laboratories. 2009. OF Glukoosiväliaine. Saatavana osoitteessa:
5. Conda Pronadisa Laboratories. OF glukoosiväliainetta. Saatavana osoitteessa: condalab.com
6. BD Laboratories. 2007. OF Basal Medium. Saatavana osoitteessa: bd.com