LÖWENSTEIN-JENSEN-ALUSTA: PERUSTA, VALMISTELU JA KÄYTTÖ - BIOLOGIA

Löwenstein-Jensen väliaine on selektiivinen kiinteä alusta eristämiseksi ja bakteerien kehittymistä Mycobacterium-suvun, kuten Mycobacterium tuberculosis, M. avium, muun muassa, kanssa lukuun ottamatta lepraen lajeja, joita ei ole viljeltävissä.

Mycobacterium-suvun bakteerit eivät kasva tavanomaisissa elatusaineissa, joten niiden eristämistä varten oli tarpeen suunnitella erityinen väliaine. Alkuperäisen välineen loi Löwenstein ja myöhemmin muutti Jensen.

Löwenstein-Jensen-elatusaine Mycobacterium tuberculosis -pesäkkeillä. Lähde: Agarwal et ai / BioMed Central Ltd., biologian kuvakirjaston luvalla

Muutos sisälsi Kongon punaisen väriaineen poistamisen korvaamalla sen korkeammalla pitoisuudella malakkiittivihreää. Se muutti myös magnesiumsitraatin ja monokaliumfosfaatin pitoisuuksia.

Löwenstein-Jensen-elatusaine sisältää tällä hetkellä perunatärkkelystä, asparagiinia, magnesiumsitraattia, monokaliumfosfaattia, magnesiumsulfaattia, malakiittivihreää, nalidiksiinihappoa, sykloheksimidiä, linkomysiiniä, pahoinpideltyjä munia, glyseriiniä ja vettä.

Mykobakteerit eristetään normaalisti kohdista, jotka eivät ole steriilejä, kuten ysköstä, virtsaa, paiseita, mm. Tämä tarkoittaa, että suurin osa näytteistä sisältää alueen tavanomaisen mikrobiootan sekä taudinaiheuttajan.

Siksi Löwenstein-Jensen-elatusaine sisältää koostumuksessaan inhibiittorisarjan, jota edustavat malakiittivihreä, antibiootit ja sienilääkkeet.

Lisäksi näytteistä, jotka tulevat ei-steriileistä kohdista, on dekontaminoitava ja neutraloitava ennen niiden siementtämistä Löwenstein-Jensen-elatusaineeseen.

Perusta

Munan ja glyseriinin esiintyminen Löwenstein-Jensen-elatusaineessa stimuloi mykobakteerien kasvua, koska ne tarjoavat rasvahappoja ja proteiineja, joita tarvitaan näiden mikro-organismien kehitykseen.

Löwenstein-Jensen-elatusaine sisältää malakkiittivihreää, joka on mukana olevan mikrobiotan estäjä. Mutta se sisältää myös nalidiksiinihappoa (35 ug / ml), joka estää gram-negatiivista mikrobiotaa, sykloheksimidiä (400 ug / ml), joka estää saprofyyttisiä sieniä ja hiivoja, ja linkomysiiniä (2 µ / ml), joka estää gram-positiivista mikrobiota.

Jotkut kaupalliset yritykset mieluummin lisäävät seuraavan yhdistelmän antibiootteja: polymyksiini B 200 000 yksikköä / L, amfoterisiini B 10 mg / L, karbenisilliini 50 mg / L ja trimetoprimi 10 mg / L.

Tämä väliaine ei sisällä agaria, joten väliaineen jähmettyminen tapahtuu munassa olevan albumiinin hyytymisen seurauksena steriloinnin aikana.

Valmistautuminen

Punnitaan 37,3 g dehydratoitua väliainetta 600 ml: ssa tislattua vettä, johon on aiemmin lisätty 12 ml glyserolia. Seosta kuumennetaan sekoittaen usein, kunnes se on täysin liuennut. Autoklaavoi väliaine 121 ° C: ssa 15 minuutin ajan.

Toisaalta on valmistettava homogeeninen suspensio, joka sisältää 1000 ml tuoreita munia, aseptisissa olosuhteissa. Lisää munasuspensio 600 ml: aan väliainetta, joka on valmistettu lämpötilassa 50 - 60 ° C, välttämättä ilmakuplia.

Antibioottisia liuoksia lisätään myös autoklaavissa steriloinnin jälkeen.

Kaada väliaine steriileihin, kierrettyihin koeputkiin. Kuumenna putkia 85 ° C: ssa 45 minuuttia kaltevassa asennossa.

Valmistetun väliaineen väri on akvamariinivihreä ja voi sisältää valkeahkoja täpliä muna-lipidien läsnäolosta johtuen.

Elatusaineen pH: n on oltava 7,2 ± 0,2

Säilytä putket jääkaapissa ja suojassa suoralta valolta käytöstä asti. Temper ennen kylvöä.

Elatusainetta on muunnettu nimellä "Löwenstein Jensenin Gruft-modifikaatio". Tämä sisältää samoja yhdisteitä kuin klassinen väliaine, mutta RNA-5 mg / 100 ml lisätään, ja estäjinä se sisältää malakiittivihreää 0,025 g / 100 ml, penisilliiniä 50 U / ml ja nalidiksiinihappoa 35 ug / ml.

Sovellukset

Löwenstein-Jensen-alustaa käytetään mykobakteerien eristämiseen erityyppisistä näytteistä. Ziehl-Neelsen-tahraa suositellaan kaikille näytteille, joissa epäillään mykobakteerien esiintymistä.

Jotkut näytteet ovat peräisin steriileistä kohdista, mutta toiset eivät. Ei-steriilit näytteet on puhdistettava tarvittaessa:

sylki

Röidenäytteet on puhdistettava seuraavasti: määritetään yskösnäytteen määrä millilitrassa ja lisätään näytteeseen sama määrä 4% NaOH: ta ja inkuboidaan 37 ° C: ssa.

Ravista seosta usein 30 minuutin sisällä. Sen jälkeen sentrifugoidaan nopeudella 3000 kierr / min 30 minuutin ajan.

Supernatantti heitetään pois fenolisen desinfiointiaineen päälle. Käytä sedimenttia kylvöön, mutta ensin pH on neutraloitava.

Neutraloimiseksi sedimentti, 5% H ₂ SO ₄ käytetään, kun läsnä on fenolia punainen merkkivalo, kunnes se saavuttaa neutraalissa pH: ssa, joka aiheuttaa lohi väri.

Mahalaukun huuhtelu, keuhkoputken huuhtelu ja keuhkoputken aspiraatti

Tässä tapauksessa näyte on sentrifugoitava nopeudella 3000 kierr / min 30 minuutin ajan. Supernatantti heitetään pois ja pellettiä käytetään. Sedimentin puhdistamiseksi lisää 3 ml 4% NaOH: ta ja sekoita usein 37 ° C: ssa puolen tunnin ajan.

Sentrifugoidaan uudelleen, supernatantti heitetään pois ja pelletti käytetään. Jälkimmäinen on neutraloitava yskösnäytteessä selostetulla tavalla.

Virtsa

Näytteen annetaan asettua jääkaapissa 24 tunnin ajan. Erota supernatantti. Jäljelle jäänyt pelletti tulisi sentrifugoida 30 minuutin ajan nopeudella 3000 RMP. Supernatantti heitetään uudestaan pois ja rekonstruoidaan pelletti 3 ml: lla steriiliä fysiologista liuosta.

Lisää 3 ml 4-prosenttista NaOH: ta ja jatka dekontaminointia ja neutralointia edellä kuvatulla tavalla.

Askiittineste, keuhkopussin neste, selkäydinneste

Tämän tyyppisessä näytteessä se sentrifugoidaan ja supernatantti heitetään pois. Suorita gramma sedimenttiin tai tarkkaile suoraan mikroskoopin alla; Jos bakteereja ei havaita, puhdistamisvaihe ei ole välttämätön, samoin kuin neutralointivaihe.

Tässä tapauksessa näyte voidaan siementaa suoraan sedimentin avulla. Jos bakteereja on, puhdista ja neutraloi yllä kuvatulla tavalla.

koepaloja

Tämän tyyppiseen näytteeseen on lisättävä 5 ml tislattua vettä myöhempään sentrifugointiin nopeudella 1500 kierr / min 10 minuutin ajan. Supernatantti heitetään pois ja sentrifugoidaan pelletti uudelleen nopeudella 3500 RPM 30 minuutin ajan. Käytä sedimenttia viljelyalustan kylvöön.

Kurkunpään tippu

Tamponi tulee asettaa steriiliin putkeen, joka sisältää yhtä suuret määrät tislattua vettä ja 4% NaOH. Tamponi on painettava putken seinämiä vasten, jotta näyte laimennetaan nesteessä. Sentrifugoi ja käytä sedimentti. Neutraloi sedimentti, kuten jo on kuvattu.

kylvetty

Löwenstein-Jensen-elatusaine siirrostetaan lisäämällä 0,5 ml näytettä kasvualustan pintaan. Kierrä putkea näytteen jakamiseksi väliaineeseen. Älä käytä platinakahvaa.

Toinen Stonebrink-elatusainetta sisältävä putki voidaan kylvää Mycobacterium bovis -bakteerin ja muiden lajien, jotka eivät kasva Löwenstein-Jensen-elatusaineessa, eristämiseksi.

itämisaika

Inokuloituja putkia inkuboidaan aerobisesti 37 ° C: ssa, korkin ollessa hieman löysä ja kallistettu noin 5 °: seen ja suojattu valolta. Ympäristöä voidaan rikastaa 5–10% hiilidioksidilla. Tarkista viljelmät kahdesti viikossa, kunnes pesäkkeitä ilmestyy.

Kun näyte on absorboitunut, korkit kiristetään. Enimmäisinkubaatioaika on 8 viikkoa. Jos tämän ajan jälkeen kasvua ei ole, se ilmoitetaan negatiivisena.

QA

Seuraavia kantoja voidaan käyttää laadunvalvontaan:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus 320of ATCC on 19615, Cryptococcus 320of ATCC of nematococcus 320of

Kolmelle mainituille lajeille odotetaan erinomaista kehitystä, sillä M. fortuitum -kasvun tulisi olla hyvä, kun taas M. bovis -kasvun odotetaan kasvavan vähän tai ei lainkaan. Samaan aikaan muita lajeja kuin Mycobacterium-sukua on estettävä kokonaan.

rajoitukset

Valmistettu väliaine on suojattava valolta, pitkäaikainen altistuminen valolle aiheuttaa väliaineen muuttumisen vihreästä siniseksi, jolloin väliainetta ei voida enää käyttää. Tämä johtuu siitä, että malakiittivihreä on valoherkkä.

Elatusaine, koska se sisältää munia, voi olla helposti saastunut, jos sitä ei käsitellä aseptisesti. Se voidaan liuottaa, jos se saastuttaa proteolyyttisiä bakteereja.

Mycobacterium-suvun bakteerien viljely ja käsittely vaatii pätevää henkilöstöä, joka on tietoinen bioturvallisuustoimenpiteistä, joita on noudatettava saastumisen tai muiden saastumisen välttämiseksi.

HCl: ää ei tule käyttää neutralointivaiheessa, koska muodostuu natriumkloridia, joka voi olla myrkyllinen Kochin bacillukselle.

Näytteitä tulisi pitää jääkaapissa ja suojata valolta, kun niitä ei käsitellä.

Viite

Francisco Soria Melguizo Laboratories. 2009. Löwenstein-Jensen-selektiivinen väliaine. Saatavana osoitteessa: f-soria.es
Britannia Laboratories. 2017. Löwenstein-Jensen-väline. Saatavana osoitteessa: britanialab.com.
Neogen Laboratories. Löwenstein-Jensen -väliaine. Saatavana osoitteessa: foodsafety.neogen.com.
"Löwenstein-Jensen väliaine." Wikipedia, ilmainen tietosanakirja. 20. marraskuuta 2018, kello 15:15 UTC. 24. huhtikuuta 2019, 18:34. wikipedia.org
Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5. toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott: n mikrobiologinen diagnoosi. 12 toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
Mac Faddin J. (2003). Biokemialliset testit kliinisesti tärkeiden bakteerien tunnistamiseksi. 3. toim. Toimituksellinen Panamericana. Buenos Aires. Argentiina.

LÖWENSTEIN-JENSEN-ALUSTA: PERUSTA, VALMISTELU JA KÄYTTÖ - BIOLOGIA - 2026