KATALAASIKOE: PERUSTEET, TEKNIIKKA JA KÄYTTÖTAVAT - BIOLOGIA - 2025

Katalaasi testi on käytetty menetelmä bakteriologiassa laboratorioissa läsnäolon paljastamiseksi entsyymikatalaasia nämä bakteerit, joilla on se. Yhdessä Gram-värjäyksen kanssa ne ovat päätestit, jotka tulisi suorittaa vasta eristetyille mikro-organismeille. Nämä testit opastavat mikrobiologia seuraavissa vaiheissa kyseisen mikro-organismin lopulliseksi tunnistamiseksi.

Yleensä sytokromia sisältävissä bakteereissa on katalaasi-entsyymi, mikä tarkoittaa, että käytännöllisillä aerobisilla ja anaerobisilla bakteereilla tulisi olla se. On kuitenkin poikkeuksia, kuten Streptococcus, joilla, vaikka ne ovatkin fakultatiivisia anaerobisia mikro-organismeja, ei ole katalaasi-entsyymiä.

Suoritetaan katalaasitesti, mikä osoittaa positiivisen reaktion. Lähde: Koneella luettavaa kirjailijaa ei toimitettu. Nase oletettu (perustuu tekijänoikeusvaatimuksiin).

Siksi katalaasikoetta käytetään ensisijaisesti erottamaan Staphylococaceae- ja Micrococaceae-perheet (molemmat katalaasipositiiviset) Streptococaceae-perheestä (katalaasnegatiivinen).

Samoin Bacillus-suku (katalaasipositiivinen) erotetaan muun muassa suvusta Clostridium (katalaasi-negatiivinen).

Perusta

Katalaasi on entsyymi, joka luokitellaan hydroperoksidaasiksi, mikä tarkoittaa, että ne käyttävät substraattina vetyperoksidia (H ₂ O ₂).

Sitä pidetään myös oksidoreduktaasina, koska reaktiossa, jossa se osallistuu, on alkuaine, joka toimii elektronidonorina (pelkistävä aine) ja toinen elektronireseptorina (hapettava aine).

Katalaasi on proteiini, joka sisältää proseriaalisen ryhmän, jossa on neljä kolmiarvoista rautaatomia (Fe ⁺⁺⁺), joten se on homoproteiini. Ferrioni-ioni pysyy hapettuneena reaktion aikana.

Voidaan sanoa, että katalaasi on vieroitusentsyymi, koska sen tehtävänä on eliminoida bakteerien metabolian aikana syntyviä aineita, jotka ovat myrkyllisiä bakteereille. Näiden aineiden joukossa on vetyperoksidi.

Vetyperoksidia muodostuu hajottamalla sokerit aerobisesti. Tämä prosessi tapahtuu seuraavasti:

Superoksidi-ioni (O ₂ ^-) (vapaa radikaali) muodostuu lopputuotteena glukoosin assimiloinnissa aerobisella reitillä. Tämä on myrkyllistä ja eliminoituu superoksididimutaasin entsyymin avulla, joka muuttaa sen kaasumaiseksi happeksi ja vetyperoksidiksi.

Vetyperoksidi on myrkyllistä myös bakteereille, ja se on poistettava. Katalaasi-entsyymi hajottaa vetyperoksidin veteen ja happea.

Katalaasi voi vaikuttaa muihin substraatteihin kuin vetyperoksidiin, kuten alkoholiin, aldehydeihin, happoihin, aromaattisiin amiineihin ja fenoleihin. Katalaasi voi kuitenkin käyttää myös vetyperoksidia hapettamaan muita myrkyllisiä yhdisteitä, kuten metyyli- ja etyylialkoholia.

Samoin katalaasia on läsnä fagosyyttisissä soluissa, suojaten sitä vetyperoksidin toksisilta vaikutuksilta.

Rutiininomainen tekniikka katalaasitestille

- Liukumäki

tarvikkeet

3% vetyperoksidia (10 tilavuutta).

Mikroskoopin liuku

Kertakäyttöinen muovikahva tai puinen hammastikku.

Prosessi

Ota riittävästi pesäkettä tutkittavaksi koskettamatta agaria, josta se tuli. Pesäkkeen on oltava tuoretta, ts. 18 - 24 tunnin viljelmästä.

Aseta pesäkkeen kuiva dia ja lisätään tippa 3% vetyperoksidia ja se (30% H ₂ O ₂ voidaan myös käyttää). Tarkastele heti, vapautuuko kuplia vai ei.

Tulkinta

Positiivinen reaktio: kaasun kehitys, josta ilmenee kuplien muodostuminen (vahva kupliva).

Negatiivinen reaktio: ei kuplan muodostumista.

-Suora menetelmä puhtaassa kulttuurissa

Sijoita 1 ml 3-prosenttista H ₂ O ₂: ta puhtaalle levylle tai kiilaviljelmälle, joka ei sisällä verta (mieluiten ravinne-agaria). Tarkkaile, onko kuplia muodostumassa heti. 30% H ₂ O ₂, voidaan myös käyttää.

Sitä tulkitaan samalla tavalla kuin porta-objektimenetelmää.

-Menetelmä kapillaariputkella tai Fung ja Petrishko

Täytä 67 mm kapillaariputki 20 mm korkeuteen 3% vetyperoksidilla kapillaarin avulla.

Kosketa tutkittavaa eristettyä pesäkettä kapillaarilla, joka on täytetty 3% H ₂ O _{2: lla} . Tarkkaile, täyttyykö kapillaari kupilla noin 10 sekunnissa. Tämä menetelmä mahdollistaa reaktion puolikvantifioinnin risteyksinä:

Ilman risteyksiä ei ole kuplia (negatiivinen reaktio).

+ ---- Muutamia kuplia (heikko tai viivästynyt reaktio).

++ --– runsaat kuplat (kohtalainen reaktio).

+++ - Kuplat saavuttavat vastakkaisen pään (voimakas reaktio).

-Taylor- ja Achanzar-menetelmä katalaasikokeille, jotka antavat kyseenalaista

Aseta eristetty pesäke puhtaalle, kuivalle objektilasille, aseta sitten tippa 0,5-prosenttista H ₂ O _{2: ta} ja peitä kansilevy. Tarkkaile, onko loukussa kuplia.

Tulkinta: kuplien esiintyminen osoittaa positiivisen reaktion. Ei kuplia, se tulkitaan negatiivisena reaktiona.

Katalaasikoe Mycobacterium-lajeille

Tämä tekniikka on tehtävä säätelemällä pH: ta ja lämpötilaa. Se on suoritettava laminaarivirtauksen alla, koska eri Mycobacterium-lajien käsittely on vaarallista.

-Materials

Vetyperoksidia 30% tai 110 tilavuutta (superoksaali).

Fosfaattipuskuri, pH 7

10% Tween 80

Mycobacterium-kiilaviljelmä 3 - 4 viikkoa

-Valmistautuminen

Fosfaattipuskuri, pH 7

Punnita:

1,361 g vedetöntä monokaliumfosfaattia (KH ₂ PO ₄).

1,420 g vedetöntä dinatrium (Na2HPO3) fosfaattia.

Liuota molemmat suolat vähän steriiliin tislattuun veteen ja täyttö tilavuudella 1000 ml vedellä.

10% Tween 80

Suorita 1:10 laimennus Tween 80: iin, joka on kaupallisesti konsentroitu, jotta tämä tapahtuu seuraavasti:

Ota 1 ml Tween 80: tä ja aseta se pieneen määrään tislattua vettä, liuotna ja täytä sitten tilavuus vedellä 10 ml: ksi.

Lopullinen reagenssi

Sekoita määrä fosfaattipuskuria 10% Tween 80: n kanssa (yhtä suuret osat). Määritä laboratoriossa, kuinka paljon haluat valmistaa.

-Prosessi

Sijoita 5 ml fosfaattipuskuria steriiliin, ruuvattuun koeputkeen (bakeliitti).

Inokulaatiosilmukalla ota tarpeeksi kiilaihin kylvetyn Mycobacterium-kasvun pesäke ja liuosta fosfaattipuskuriin.

Sulje putki kiristämättä lankaa liikaa. Aseta vesihauteeseen 68 ° C: seen 20-30 minuutiksi. Ota ulos ja anna jäähtyä 22-25 ° C: seen

Mittaa 0,5 ml lopullista reagenssia (sekoitetaan) ja lisää se putkeen kylmällä liuoksella. Tarkkaile kuplien muodostumista.

Se tulkitaan samalla tavalla kuin aikaisemmat tekniikat.

Käyttää

Kun pesäkkeiden kasvu saadaan rikastetuissa väliaineissa, saaduille pesäkkeille tulisi suorittaa Gram-värjäys- ja katalaasikoe. Tämä opastaa mikrobiologia noudattamaan lopullista tunnistamista koskevia menettelytapoja.

Lähde: Valmistaja kirjoittanut MSc. Marielsa gil

QA

Vetyperoksidireagenssin hyvän suorituskyvyn arvioimiseksi käytetään tuoreviljeltyjä kontrollikantoja, kuten Staphylococcus aureus positiivisena kontrollina ja Streptococcus sp -kantoja negatiivisena kontrollina.

Toinen vaihtoehto, joka toimii positiivisena kontrollina, on laittaa tippa vetyperoksidia veriagaria, erytrosyyteissä on katalaasia, joten kupliminen tapahtuu, jos reagenssi on hyvässä kunnossa.

Suklaa-agaria voidaan käyttää negatiivisena kontrollina, tässä punasolut on jo hajotettu ja testi on negatiivinen.

rajoitukset

-Älä käytä testissä vanhoja viljelmiä, koska se voi aiheuttaa vääriä negatiivisia.

- Vältä pesäkkeiden ottamista vilja-agar-viljelmistä, jos olet varovainen, ettet kosketa agaria; Tämä toimenpide voi johtaa vääriin positiivisiin tuloksiin, koska punasolut sisältävät katalaasia.

-Jos otat pesäkkeen platinakahvalla, älä käännä toimenpidejärjestystä, koska se voi aiheuttaa vääriä positiivisia tuloksia. Tämä johtuu siitä, että platina pystyy reagoimaan vetyperoksidin kanssa aiheuttaen kuplimisen.

-Älä käytä vetyperoksidireagenssia, jos se on hyvin vanhaa, koska reagenssi on erittäin epävakaa ja pyrkii hajoamaan ajan myötä.

- Pidä vetyperoksidireagenssia valolta suojattuna ja jäähdytettynä vaurioiden välttämiseksi.

- Suorita vetyperoksidireagenssin laadunvalvonta aina, kun sitä käytetään.

-Ota huomioon, että jos käytetään 30% H ₂ O _2: ta, reaktiot ovat voimakkaampia kuin 3% H ₂ O _{2: lla suoritetut}.

Viitteet

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5. toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott: n mikrobiologinen diagnoosi. 12 toim. Toimituksellinen Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Biokemialliset testit kliinisesti tärkeiden bakteerien tunnistamiseksi. 3. toim. Toimituksellinen Panamericana. Buenos Aires. Argentiina.
4. BD Laboratories. Katalaasi-Gotario-reagenssi. Saatavana osoitteessa:
5. Vadequímica Laboratories. Peroksidia. Määrä ja prosenttiosuus. Saatavana osoitteessa vadequimica.com