ITIÖVÄRJÄYS: PERUSTEET, TEKNIIKAT JA KÄYTÖT - BIOLOGIA - 2025

Itiö värjäytyminen on menetelmä, jota käytetään väri vastus rakenteita, jotka muodostavat noin bakteerien suvuista kun epäsuotuisissa olosuhteissa; Nämä rakenteet vastaavat selviytymismuotoa.

On monia suvuja, jotka muodostavat itiöt; tärkeimmät ovat kuitenkin Bacillus ja Clostridium. Näiden sukujen katsotaan olevan merkityksellisempiä, koska niillä on ihmisille patogeenisiä lajeja.

Itiövärjäys Shaeffer - Fulton- tai Wirtz-Conklin -menetelmällä. Ja tambe (alkuperäinen lähettäjä), Wikimedia Commonsista

Jokainen bacillus voi aiheuttaa itiön. Valmisteen värjäyshetkellä itiö löytyy bacilluksesta (endospoori) tai sen ulkopuolelta (exospora). Tavanomaisilla bakteerien värjäystekniikoilla - kuten Gram-värjäys - itiöt pysyvät värittöminä.

Tällä hetkellä on olemassa useita värjäysmenetelmiä, jotka kykenevät läpäisemään itiön paksun rakenteen sen värjäämiseksi. Nämä menetelmät ovat hyvin erilaisia; Näitä ovat Dorner-tekniikka, Möeller-tahra ja Shaeffer - Fulton -menetelmä, joka tunnetaan myös nimellä Wirtz-Conklin.

Kaikista mainituista tekniikoista Shaeffer-Fulton -menetelmä on laajimmin käytetty rutiinilaboratorioissa. Se on nimetty kahden mikrobiologin, jotka loivat värin vuonna 1930, mukaan: Alicia Shaeffer ja MacDonald Fulton. Kuitenkin tekniikka on joskus nimetty Wirtz-Conklin jälkeen kaksi bakteerit 1900-luvulta.

Perusta

Itiöt eivät värjää tavanomaisilla tahroilla, koska niiden seinä on erittäin paksu. Itiöiden monimutkainen koostumus estää useimpien väriaineiden pääsyn.

Jos itiötä tutkitaan ulkopuolelta, havaitaan seuraavat kerrokset: ensin on eksosporium, joka on ohuin ja ulompi kerros, jonka glykoproteiinit muodostavat.

Seuraavaksi tulee kynsinauha, joka tarjoaa kestävyyden korkeille lämpötiloille, jota seuraa peptidoglykaanista koostuva aivokuori. Myöhemmin alustan seinä suojaa protoplastia.

Itiö on kuivattu rakenne, joka sisältää 15% kalsiumia ja dipikoliinihappoa. Siksi suurin osa itiöiden värjäystekniikoista riippuu lämmön käytöstä niin, että väriaine voi tunkeutua paksuun rakenteeseen.

Kun itiö on värjätty, se ei voi poistaa väriainetta. Shaeffer-Fulton-tekniikassa malakiittivihreä kulkeutuu vegetatiivisiin soluihin ja lämpöä käytettäessä tunkeutuu sekä endospoorin että eksospoorien läpi.

Pesemällä vedellä, väriaine poistetaan kasvullisesta solusta. Tämä tapahtuu, koska malakiittivihreä väriaine on hieman emäksinen, joten se sitoutuu heikosti kasvullisiin soluihin.

Sen sijaan se ei pääse ulos itiöstä ja lopulta bakteeri rikastuu safraniinilla. Tämä perusta on voimassa muille tekniikoille, joissa tapahtuu jotain vastaavaa.

Itiövärjäystekniikat

Itiövärjäyksen suorittamiseksi on saatava tutkittavan epäilyttävän kannan puhdas viljelmä.

Viljelmälle altistetaan 24 tunnin ajan äärimmäisissä lämpötiloissa mikro-organismin stimuloimiseksi itiöimiseksi. Tätä varten viljelmä voidaan laittaa uuniin 44 ° C: seen tai jääkaappiin (8 ° C) 24 tai 48 tunniksi.

Jos jätetään liian kauan mainituissa lämpötiloissa, havaitaan vain eksospooreja, koska kaikki endospoorit ovat jo poistuneet bacilluksesta.

Ajan lopussa muutama tippa steriiliä fysiologista liuosta tulisi laittaa puhtaalle objektilasille. Sitten otetaan pieni osa viljelmästä ja levitetään hienoksi.

Sen jälkeen se jätetään kuivumaan, kiinnitetään lämmölle ja värjätään jollakin alla selitetyistä tekniikoista:

Dorner-tekniikka

1- Valmista koeputkessa itiöityyn mikro-organismin väkevöity suspensio tislattuun veteen ja lisää sama määrä suodatettua Kinyoun-karbolifuksiinia.

2 - Aseta putki kylpyyn kiehuvalla vedellä 5-10 minuutiksi.

3 - Sekoita puhtaalla levyllä tippa aikaisempaa suspensiota tippaan 10-prosenttista vesipitoista nigrosiiniliuosta, keitetään ja suodatetaan.

4- Levitä ja kuivaa nopeasti miedolla lämmöllä.

5- Tutki 100X-objektiivilla (upotus).

Itiöt värjäävät punaisina ja bakteerisolut näyttävät melkein värittömiltä tummanharmaata taustaa vasten.

Muokattu Dorner-tekniikka

1- itiöllisen mikro-organismin suspensio levitetään objektilasille ja kiinnitetään lämmölle.

2 - Näyte peitetään suodatinpaperinauhalla, johon lisätään karbolifuksiinia. Väriainetta kuumennetaan 5 - 7 minuutin ajan Bunsen-polttimen liekillä, kunnes höyryt kehittyvät. Sitten paperi poistetaan.

3 - Valmiste pestään vedellä ja kuivataan sitten imukykyisellä paperilla.

4- Peitä muste ohuella 10-prosenttisella nigrosiinikalvolla, käyttämällä toista dioa nigrosiinin tai neulan levittämiseen.

Itiöiden ja bakteerien ottama väri on sama kuin tunnetussa tekniikassa kuvataan.

Shaeffer - Fulton- tai Wirtz-Conklin-tekniikka

1- Tee hieno sively itiöllisen mikro-organismin suspensiolla levylle ja kiinnitä lämpöä.

2- Peitä objektilasi 5-prosenttisella malakkiittivihreällä vesiliuoksella (voit sijoittaa suodatinpaperin objektilasille).

3 Kuumenna Bunsen-polttimen liekin yli, jotta höyryjä vapautuu, ja liekki poistetaan. Toista toimenpide 6-10 minuutin ajan. Jos malakiittivihreä liuos haihtuu liikaa menettelyn aikana, sitä voidaan lisätä lisää.

4- Poista suodatinpaperi (jos asennettu) ja pese vedellä.

5- Peitä objektilasi 0,5-prosenttisella vesipitoisella safraniinilla 30 sekunnin ajan (joissakin tekniikan muodoissa käytetään 0,1-prosenttista vesipitoista safraniinia ja jätetään se 3 minuutiksi).

Tällä tekniikalla itiöt näyttävät vihreiltä ja bacillit punaisilta.

Sillä on haittana, että nuorten viljelmien endospoorit eivät värjää hyvin, koska ne näyttävät erittäin kirkkailta tai värittömiltä. Tämän välttämiseksi on suositeltavaa käyttää 48 tunnin inkubointiviljelmiä.

Möeller-tekniikka

1- Peitä muste kloroformilla 2 minuutin ajan.

2- Hävitä kloroformi.

3 - Peitä 5-prosenttisella kromihapolla 5 minuutin ajan.

4 - Pese tislatulla vedellä

5- Arkki peitetään karbolifuksiini-fenicadalla ja altistetaan Bunsen-polttimen liekille, kunnes höyryjä vapautuu; sitten se poistetaan liekistä hetkeksi. Toisto toistetaan, kunnes 10 minuuttia on kulunut loppuun.

6- Pese vedellä.

7- Käytä happamatonta etanolia (kloorivetyalkoholia) värin muuttamiseksi. Se jätetään 20 tai 30 sekunniksi.

8- Pese tislatulla vedellä.

9 - Kontrastoi peittämällä arkki metyleenisinisellä 5 minuutin ajan.

10- Pese tislatulla vedellä.

11 - Anna kuivua ja näyte viedään mikroskoopille.

Itiöt näkyvät punaisina ja baciilit sinisinä. On tärkeää olla hengittämättä höyryjä, koska ne ovat myrkyllisiä ja voivat pitkällä aikavälillä olla syöpää aiheuttavia.

Muunnettu Möeller-tekniikka ilman lämpöä

Vuonna 2007 Hayama ja hänen yhteistyökumppaninsa loivat muutoksen Möeller-tekniikkaan. He eliminoivat väriaineen kuumennusvaiheen ja korvasivat sen lisäämällä 2 tippaa pinta-aktiivista ainetta Tergitol 7 jokaisesta 10 ml: sta karbolifuksiini-karbooliliuosta. Samat tulokset saatiin.

Sovellukset

Itiöiden värjäys tarjoaa erittäin arvokasta ja hyödyllistä tietoa taudinaiheuttajan tunnistamiseksi, koska sen esiintyminen, muoto, sijainti bacilluksessa ja kyky muodonmukaista vegetatiivista solua tai eivät, ovat tietoja, jotka voivat ohjata lajia mukana tietyssä genressä.

Tässä yhteydessä on syytä sanoa, että itiöt voivat olla pyöreitä tai soikeita, ne voivat sijaita keskiosassa tai myös keskiasentoon, subminoituun tai pääteasentoon.

Kaavio endospoorien ja eksospoorien muodosta ja sijainnista

esimerkit

- Clostridium difficile muodostaa soikean itiön pääteasennossa, joka muuttaa bakteerin muodon.

- Clostridium tertiumin itiö on soikea, ei deformoi bacillusta ja sijaitsee terminaalitasolla.

- Clostridium tetani: n endospoori on terminaalinen ja muodonmuutos bacillusta antaen rumputävyn.

- Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy ja C. septicum itiöt ovat pyöreitä tai subterminaalisia soikeita ja muuttavat bacillusta.

- Clostridium sordellin endospoori sijaitsee keskiasennossa pienellä muodonmuutoksella.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. (5. painos). Argentiina, Toimitus Panamericana SA

Viitteet

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Ehdotus yksinkertaistetusta tekniikasta bakteerien itiöiden värjäämiseksi ilman lämpöä - Moeller-menetelmän onnistunut modifiointi. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Wikipedian avustajat. Moeller-tahra. Wikipedia, ilmainen tietosanakirja. 3. marraskuuta 2018, 03:28 UTC. Saatavana osoitteessa: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Mikrobiologisten tekniikoiden laboratorio-opas. Perustieteiden laitos Mikrobiologian akatemia. Kansallinen ammattikorkeakoulu.
4. "Sisäitiöitä." Wikipedia, ilmainen tietosanakirja. 25. helmikuuta 2018, kello 10:20 UTC. 10. tammikuuta 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J ja yhteistyökumppanit. (2006). Extremaduran itsehallintoalueen työvoimahenkilöstö. Erityisohjelma, nide IV. Toimituksellinen MAD. Sevilla - Espanja, s. 211 - 212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006), erikoistunut laboratorioteknikko, Galician terveyspalvelu (SERGAS). Erityisen aiheen esityslistan osa 2. Toimituksellinen MAD. Sevilla, Espanja, s. 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. (5. painos). Argentiina, Toimitus Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott: n mikrobiologinen diagnoosi. 12 toim. Argentiina. Toimituksellinen Panamericana SA